[发明专利]转ICS1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法

说明书

本发明是一种生物技术领域的转ICS1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明从青蒿中克隆异分支酸合成酶ICS1基因，构建含ICS1基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ICS1基因转入青蒿并再生出植株，PCR检测外源目的基因ICS1的整合情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定(HPLC‑ELSD)转基因青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明获得的转基因青蒿中青蒿素含量显著提高，最高达到非转化对照植株的1.90倍，从而提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的提高青蒿素含量的方法，特别是一种转ICS1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。其地上部分所提取的含有过氧桥的倍半萜内酯氧化物——青蒿素，是目前应用最广泛，疗效最好的抗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，青蒿素联合疗法(ACTs)是世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法。随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗肿瘤、抗癌以及免疫调节的功能。

然而青蒿素在植物青蒿中的含量非常低，大规模商业化生产受到了限制，无法完全满足全球的市场需求。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具可行性。通过酵母工程生产青蒿素，前期投入成本大，且产量有限不能满足需求。现有技术表明植物基因工程为提高青蒿中青蒿素的含量提供了一个可行的方法。

青蒿具有分泌型腺毛(glandular trichomes)和非分泌型腺毛(nonglandulartrichomes)。在青蒿叶片的正面和背面、茎秆、花上都大量存在分泌型腺毛，这里是大量次生代谢物的累积场所，青蒿素也被认为储存于此处。

水杨酸(Salicylic acid,SA)是重要的植物激素,在植物的生长发育上起了非常重要的作用，并与植物的抗病防御密切相关。异分支酸合成酶(Isochorismate synthase,ICS)是植物水杨酸合成途径的其中一个关键酶,负责将分支酸转化为异分支酸，然后进一步合成最终产物水杨酸。ICS1基因水杨酸调控的抗逆有关联。对ics1突变体研究发现，缺失ICS1基因的植株内源水杨酸含量也极低。因此，克隆ICS1基因并转化青蒿，对探究水杨酸合成途径和青蒿素途径的代谢协调及基因工程育种具有重要意义。

本发明致力于采用基因工程手段，获得青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供一条新途径。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种转ICS1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明涉及的基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、青蒿素提取及含量测定用于本发明，建立了稳定提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用青蒿大规模生产青蒿素奠定了基础。

本发明提供一种转ICS1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括以下步骤：

(1)采用基因克隆方法获得ICS1基因；

(2)把所述ICS1基因连接于表达调控序列，构建含ICS1基因的植物表达载体；

(3)将所述含ICS1基因的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得含所述ICS1基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

(4)利用所述含ICS1基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的整合外源目的基因ICS1的转基因青蒿植株。

进一步地，所述ICS1基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述ICS1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。