[发明专利]一种生化微反应体系、高通量测序的建库仪及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种生化微反应体系、高通量测序的建库仪及应用。

背景技术

目前DNA测序仪的市场上主流的是第二代高通量测序平台，主要包括 Illumina2000/2500/4000、罗氏公司的454测序仪、ABI公司的SOLID测序仪，在基因样本准备上机进行测序前，都需要制备测序文库。建库(文库制备)过程涉及到基因样本加入、加入缓冲液及酶试剂混合液、PCR(聚合酶链式反应)、磁珠纯化等工艺环节，流程复杂且所使用液体体系庞大，发生混样及样品污染风险极高。

为解决上述困难，现有的全自动文库制备方案有如下两种：一是基于传统的文库制备方法，试剂及样本体系均保持不变，采用移液工作站将制备过程自动化，具体以PerkinElmer Janus NGS Express为代表，缺点是单次运行只能实现最大通量24份，且耗费大量一次性塑料耗材及试剂。二是基于预先将文库制备试剂封装入密封试剂盒，使用限制性内切酶对DNA分子进行剪切，数字微流体控制纳升级大小液滴，将DNA样本自动装载入一次性文库卡片(Library card)，典型的技术是Illumina NeoPrep台式建库仪。该技术的自动化程度高、流程精简，但文库制备的样本通量小(16份)，且只适用于Illumina测序平台。

现有的建库方法中，为了确保相对高浓度的靶样品，通常的样本体积范围为200μL，试剂体积大于200μL，相对大体积的反应体积会导致高试剂成本，同时还需要大量使耗费一次性耗材(如枪头等)。

发明内容

有鉴于此，本发明第一方面提供了一种新型油包水的生化微反应体系，并基于该生化微反应体系提供了一种高通量测序的建库仪，可以降低反应体系的体积，减少样品用量，确保生化反应过程内每个单独样品的完全控制和分离，避免交叉污染，还可节省大量耗材。

第一方面，本发明提供了一种生化微反应体系，用于制备测序的核酸文库和核酸扩增，所述生化微反应体系包括第一油性液体、第二油性液体、水基基因样品和反应试剂，其中，所述第一油性液体的密度大于所述第二油性液体，所述水基基因样品和反应试剂被包埋在所述第一油性液体、第二油性液体之间构成夹心结构，所述水基基因样品和反应试剂与所述第一油性液体、第二油性液体均不相混溶且不发生反应，所述第一油性液体、第二油性液体不互溶。

优选地，所述基因样品为片段化的DNA或RNA样品的水性溶液；所述反应试剂为基因样品的核酸扩增、测序的核酸文库制备中常用的试剂，所述反应试剂包括生物酶、缓冲溶液、酸和碱中的一种或多种。

优选地，所述第一油性液体的密度大于纯水密度，其密度为1.01-2.0g/cm³。进一步优选为1.01-1.2g/cm³、1.6-1.95g/cm³。

优选地，所述第二油性液体的密度小于纯水密度，其密度为0.09-0.99g/cm³。

优选地，所述第一油性液体与所述第二油性液体的体积比为1：(2-4)。

本发明第一方面提供的生化微反应体系，采用密度不同的两种不互混的油性液体来包埋微量的基因样品和反应试剂，第一油性液体在下，第二油性液体在上，可以将不同比重的试剂及基因样品完全包埋在两种油性液体之间，形成双油包水的“夹心”结构，使基因样品和反应试剂的所有反应在该“油包水”的生化微反应体系中完成，以达到降低反应体系的体积的目的。

第二方面，本发明提供了一种高通量测序的建库仪，所述高通量测序的建库仪，包括机台以及设置在机台上的驱动机构，所述机台上还设有控制器、恒流泵、纯化板、试剂区、反应孔板；所述试剂区包括多个试剂槽，所述多个试剂槽用以盛放第一油性液体、第二油性液体、水基基因样品、磁珠纯化液、洗脱液和多种反应试剂；所述反应孔板包括阵列分布的反应孔位；

所述驱动机构上连接有微量加样装置和纯化板，所述控制器控制所述驱动机构带动所述纯化板和所述微量加样装置在机台内移动，并控制所述微量加样装置吸取、排出试剂；

所述纯化板包括纯化板本体、阵列设置在纯化板本体上的管道插入孔和多个毛细管道，所述毛细管道穿过所述管道插入孔并在所述纯化板本体的上方和下方分别具有第一延伸端和第二延伸端，在靠近所述第一延伸端处，所述纯化板本体上还放置有多个磁体，形成所述毛细管道的磁力区，所述第一延伸端与所述恒流泵管道连接；所述第二延伸端用于在所述驱动机构的带动下插入试剂槽及所述反应孔位内；