[发明专利]一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法。

背景技术

乌司他丁，又名人尿胰蛋白酶抑制剂(Urinarytrypsininhibitor，简称为UTI)是一种从人尿中分离纯化的由143个氨基酸组成的糖蛋白，等电点在2.6左右，分子量67000Da左右，具有抑制多种蛋白酶、糖酶和脂酶等水解酶的活性；从而抑制炎症介质的过度释放；改善微循环和组织灌注。而在机体受到严重损伤时起抑制全身性炎症反应(SIRS)的发生发展、继而阻断多脏器功能障碍(MODS)，保护脏器功能等作用。

人尿中含有三百多种蛋白质，目前已开发提取的主要有尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制剂和人尿激肽原酶等，这些组分在临床上具有重要的治疗价值。

人尿激肽原酶(UrinaryKallidinogenase，简称为KN)，是从人尿中分离提取的一种由238个氨基酸组成的糖蛋白，等电点在4左右，分子量约54000D左右，属于丝氨酸蛋白酶。它能够激活人血浆激肽原转化为激肽。目前，已经被开发成用于治疗急性脑梗死的药物。

目前临床使用的乌司他丁产品，由于存在杂蛋白及一些有色基团，导致其效价低，稳定性不好，特别是存在少量人尿激肽原酶(KN)而使产品有潜在的副作用。尤其是KN和UTI，二者分子大小相近，且均为酸性蛋白，常规的纯化方法对其较难分离，后续纯化困难。

目前国内纯化人尿胰蛋白酶抑制剂的方法主要为经典的气泡提取法结合亲和层析、离子交换法、亲和层析法、分子筛层析、金属螯合层析和疏水层析法等，以及尿胰蛋白抑制剂和尿激肽释放酶联产工艺，这些方法由于纯化方法吸附效率低，往往需要结合多步层析，造成工艺步骤多，产品收率低，生产周期长，不易放大；另外，多步层析使用的纯化介质成本昂贵，不利于工业生产。特别是针对分离除去人尿激肽原酶(KN)的纯化技术还是靠反复的层析，对产品损失比较大。因此，除掉人尿激肽原酶(KN)及其他杂质进一步提高乌司他丁的质量是十分必要的，也是急需待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是克服现有乌司他丁纯度不高、收率过低、不稳定的缺陷，采用基于疏水柱层析来纯化乌司他丁，从而提高了乌司他丁收率和纯度。提供了一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法。

近年来，随着疏水层析介质在蛋白分离中应用的研究，和对人尿胰蛋白酶抑制剂和人尿激肽原酶的疏水特性的研究发现，利用疏水层析柱的特殊吸附性可一步纯化人尿胰蛋白酶抑制剂。

为了解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

将乌司他丁粗品经过前处理，通过疏水柱层析进行纯化，洗脱液超滤，即得高纯度的乌司他丁，所得纯化后的乌司他丁总收率提高到75％以上，产品比活达到4000U/mg·pr以上。

所述的疏水柱层析包括以下步骤：

1)前处理：将乌司他丁粗品溶解在水中，以质量g/体积ml计，乌司他丁∶水为1∶2，再用硅藻土过滤，收集滤液，加入ZnCl₂使其终浓度为150mmol/L，用预冷的95％乙醇沉淀，用量以体积ml/ml比计，样品溶解液体积∶95％乙醇体积为1∶1.1，搅拌30min，板框过滤，取上清液，调电导50～55ms/cm，冰醋酸调pH4.0；样品溶解液体积∶95％乙醇体积为1∶2.3，搅拌30min，板框过滤，取沉淀物后，将沉淀物溶解于3倍体积的水。

2)上样及洗涤：用pH3.5～4.5，1.5～2.0mol/L(NH₄)₂SO₄－0.05～0.15mol/L醋酸缓冲液平衡层析柱，上样，上样溶液的蛋白浓度为25～30mg/mL胶，用pH3.5～4.5，1.5～2.0mol/L(NH₄)₂SO₄－0.05～0.15mol/L醋酸缓冲液洗涤；

3)洗脱：用pH4.0～6.0、0.08mol/L磷酸盐缓冲液－0.4mol/L氯化钠溶液进行洗脱；洗脱液用超滤膜超滤，即得纯化的乌司他丁原料药。

所述的疏水柱介质选自：PhenylBio-sepFF、PhenylBio-sepHP和ButylBio-sepHP中的一种。

所述的洗涤液优选pH值为4.0的1.5mol/L(NH₄)₂SO₄－0.1mol/L醋酸缓冲液。

所述的洗脱液优选pH值为5.5的0.08mol/L磷酸盐缓冲液－0.4mol/L氯化钠溶液。