[发明专利]一种蛋白酶及其制备和应用

权利要求书

1.一种蛋白酶，其特征在于它的核苷酸序列为SEQIDNO.1，该序列能编码所述蛋白酶。

2.权利要求1所述蛋白酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2。

3.权利要求1所述蛋白酶的制备方法，其特征在于所述方法包括构建原核表达载体，利用超滤和离子交换方法纯化重组蛋白，表达载体为PET22b，所用的酶为NcoI和HindIII，其中特异性引物5’-CATGCCATGGATGCAAGTACAGGCAGTC-3’为PCR扩增反应的正向引物，5’-CCCAAGCTTATTTTATCTGTACCACGC-3’为相应的反向引物，以蛋白酶的DNA为模版，进行PCR扩增反应，获得带有酶切位点的目的片段，将目的基因与载体双酶切后连接，连接产物转化到感受态细胞E.coliBL21(DE3)中，涂布在Amp/LB琼脂固态培养基上培养，将长出的阳性克隆重组菌培养发酵，发酵液经离心通过超滤、硫酸铵沉淀、离子交换方法分离纯化得到重组蛋白。

4.权利要求1或2所述蛋白酶的制备方法，其特征在于它的具体步骤如下：

1)采用特异的引物对编码蛋白的基因进行扩增，扩增的同时在引物上设计NcoI和HindIII的酶切位点，引物为：

Forward：5’-CATGCCATGGATGCAAGTACAGGCAGTC-3’

Reverse：5’-CCCAAGCTTATTTTATCTGTACCACGC-3’

PCR扩增体系为：2×ESTaqMasterMix25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，DNA模板2μL，加FreeWater至50μL；PCR扩增条件为：90～96℃预变性4～7min，902～97℃变性30s，54～60℃退火30s，72～77℃延伸0.9～1.2min，循环25～35次，最后71～76℃延伸8～12min；

2)用NcoI和HindIII分别双酶切PET22b质粒和扩增产物，电泳后回收目的产物，然后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，将目的基因与载体连接，最后将连接产物转化到感受态细胞E.coliBL21(DE3)中，涂布在Amp/LB琼脂固态培养基上，37℃过夜培养，获得重组菌株，其中氨苄浓度为100～122mg/L，琼脂浓度为1.9～2.3％；

3)将重组菌株接种于灭菌后的初始发酵液中，在37℃，200～300r/min下，发酵培养，待培养至OD600＝0.7～1.0时，加入终浓度为0.8～1.2mM的IPTG，30℃，100～300r/min诱导8～10h，得到发酵菌液，所述的初始发酵液，以质量分数计，包括0.9～1.6％的胰蛋白胨，0.8～1.4％的氯化钠，0.5～0.7％的酵母提取物，余量为水；

将发酵液离心，取上清，然后使用3kd、50kd的超滤膜截留；接着使用30％～60％的硫酸铵沉淀，将得到的沉淀重溶后透析、除盐；然后使用阳离子交换色谱，经过挂柱、洗脱，得到纯化的活性蛋白。

5.权利要求1-4任何一项所述蛋白酶或所述方法制备的蛋白酶的应用，所述应用包括在洗涤工业、制革工业和食品工业中应用。

6.权利要求1-4任何一项所述蛋白酶或所述方法制备的蛋白酶在制备消炎剂中的应用。