[发明专利]阻遏蛋白、调控元件组和基因表达调控系统及其构建方法

说明书

本发明通过将多聚化结构域引入阻遏蛋白，并在优选的实施方式中对与阻遏蛋白相互作用的操纵位点的数目进行优化，获得具有超灵敏调控性能的阻遏蛋白、调控元件组和基因表达调控系统。

技术领域

本发明属于合成生物学领域，涉及工程化阻遏蛋白、超灵敏调控元件组和基因表达调控系统及它们的构建方法。

背景技术

合成生物学借助生物元件标准化和概念抽象对细胞进行“编程”，允许人工设计的基因网络执行各种任务。近年来，随着合成生物学的快速发展，网络结构与功能之间的联系逐渐建立，基因电路(circuit)和通路(pathway)的可预测性大大提高，使得对蛋白节点、通路甚至网络的精准和动态控制成为可能。

目前的一个研究热点在于，将合成生物学用于对发酵工程中的细胞代谢通路进行动态调控[1-3]。人工构建的动态调控网络与天然网络类似，常常利用变构抑制或转录水平的负反馈回路来调控关键酶的表达，以改变代谢流[4]。例如，可利用合成网络对响应于外源刺激或内源代谢产物的蛋白类型阻遏物(即阻遏蛋白)的动力学特性或蛋白-蛋白相互作用进行调整，实现对阻遏物动态调节性质的优化，从而提高代谢产物的产率。特别地，包含阻遏物的负反馈系统使得内源代谢物能够驱动“修复”电路，以自行调节的方式处理代谢异常从而维持体系稳定[5-6]。然而，由于存在漏表达、希尔系数过小等问题，这些合成调控网络的性能常常并不令人满意。

现有技术通过对阻遏物进行工程化，改造天然网络的动力学性质。作为一个实例，枯草芽孢杆菌阻遏蛋白FapR对参与脂肪酸和磷脂代谢的多个基因进行负调控，其特异性结合至17bp DNA序列，响应于丙二酸单酰辅酶A这一重要化合物的浓度而变构[7-8]。当丙二酸单酰辅酶A的水平超过阈值，变构后的FapR从操纵位点上解离下来，从而解除转录阻遏。借助这样的方式，FapR起到脂肪酸生物合成状态传感器的作用。能够通过将与FapR相关的转录动力学网络进行工程化[4]，或者在代谢通路中引入反馈调控[9]来提高产率。例如，Xu等利用FapR的上述特性构建了具有双向开关性质的整合式丙二酸单酰辅酶A传感器。能够通过加入不同数目的串联的操纵序列fapO来改变传感器对基于pGAP的丙二酸单酰辅酶A的动态响应的灵敏度，使得每一侧开关打开时启动子的饱和活性相匹配，从而脂肪酸的产量大幅提升[4]。这一优异效果显示了工程化的阻遏物在实现网络动态调控方面的潜力，然而，该网络构建方法很大程度上依赖于FapR的特定性质，并不能普遍适用于对阻遏物进行工程化。

此外，为了在基因网络动态调控中实现超灵敏的开关式响应，本领域仍需要诸如对响应效率或阻遏物倍数变化等进行改进的简单设计理念。最近的研究通过添加辅阻遏物结合位点对背景表达进行控制，以增强输出的信噪比[10]。作为不同的发明构思，本发明的发明人受到首个分离的开关样转录阻遏物—λ噬菌体的CI蛋白以及细菌的LacI蛋白[11-12]的启发，将协同作用引入调控系统的设计，从而能够构建更为有效的基因开关。

发明内容

在第一方面，本发明提供了一种提高阻遏蛋白转录阻遏能力的方法，所述方法包括：将多聚化结构域可操作地连接至所述阻遏蛋白的DNA结合结构域，其中，所述多聚化结构域选自于由CI家族阻遏蛋白的多聚化结构域所组成的组。

在第二方面，本发明提供了一种阻遏蛋白，所述阻遏蛋白包含多聚化结构域和DNA结合结构域，其中，所述多聚化结构域选自于由CI家族阻遏蛋白的多聚化结构域所组成的组。

在第三方面，本发明提供了一种提高基因调控网络灵敏度的方法，所述方法包括：

将多聚化结构域可操作地连接至所述基因调控网络中的阻遏蛋白，其中，所述多聚化结构域选自于由CI家族阻遏蛋白的多聚化结构域所组成的组；以及

将与所述阻遏蛋白相互作用的启动子设置为包含与所述阻遏蛋白的DNA结合结构域相互作用的一个或两个操纵位点对。

在第四方面，本发明提供了一种改善宿主细胞中启动子的开关性质的方法，所述方法包括：