[发明专利]一种重组人胰岛素结晶的制备方法

权利要求书

1.一种重组人胰岛素结晶的制备方法，其特征在于，所述方法由以下步骤组成：

1)将含有重组人胰岛素的反向高效层析液，加入锌盐溶液，使每OD₂₈₀nm的重组人胰岛素中含有锌离子的浓度为10-55mg/ml,加入低温纯化水，当胰岛素溶液浓度稀释到0.5-6mg/ml时，搅拌；

2)向步骤1)中胰岛素溶液加入3-5M的氨水进行调沉，直到pH为5.5-7.5之间时，停止搅拌，得到一次结晶液；将一次结晶液转移至一结结晶罐中静置沉降，沉降后，测定上清液OD₂₈₀nm小于等于0.2时，排除上清液,得到一结结晶；

3)将一结结晶转移到二结调沉罐中，向二结调沉罐中加入1-3M醋酸进行溶解，搅拌，待一结结晶完全溶解后停止添加醋酸和搅拌，然后向罐中补入常温纯化水，使其稀释浓度为3-18mg/ml；

4)继续搅拌，待溶液搅拌均匀后进行调沉，向罐中加入3-5M氨水调节溶液pH值至5.5-7.5，停止搅拌，观察晶体，待晶体形成后，得到二次结晶液；将二次结晶液转移至二结结晶罐中静置沉降，沉降后，测定上清液OD₂₈₀nm值小于等于0.2时，将上清液排掉；得到二结结晶；

5)向二结结晶罐中加入常温纯化水,搅拌，加入1-3M醋酸，待结晶完全溶解后停止添加醋酸和搅拌；

6)向步骤5)的二结结晶罐中补加锌盐溶液，使其锌离子浓度为0.3-1.6×10^—4mg/ml，搅拌均匀后，经无菌滤芯过滤后，转移至已经灭菌的三结调沉罐中；

7)向三结调沉罐中加入常温注射用水，稀释浓度范围为3-18mg/ml，搅拌；

8)向步骤7)的三结调沉灌中加入3-5M氨水溶液调节溶液pH值，当溶液pH值调至5.5-7.5后，观察晶体，待晶体形成后，得到三次结晶液；将三次结晶液转移至三结结晶罐中，静置沉降，过滤，得到重组人胰岛素结晶。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述锌盐溶液为氯化锌；低温纯化水温度为2-8℃；胰岛素溶液稀释到4mg/ml。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)，调节pH为5.5-6.5，搅拌的速度为50-100转/分钟；沉降时间为大于等于10小时；沉降后，测定上清液OD₂₈₀nm小于等于0.1时，去除上清液,得到一结结晶。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述打开搅拌器后，搅拌速度50-100转/分钟，所述常温纯化水的温度为20-25℃。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述一次结晶溶解液的稀释浓度范围为5mg/ml。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)，所述pH5.5-6.5，所述二结结晶罐中二次结晶液沉降大于等于10小时；沉降后，测定上清液OD₂₈₀nm值小于等于0.1时，将上清液排掉；得到二结结晶。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5)加入常温纯化水的温度为20-25℃；加入纯化水的量使重组人胰岛素样品的浓度至25-60mg/ml。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤6)所述锌浓度1.5×10^—4mg/ml，所述过滤为使用0.22μm的无菌滤芯过滤。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤7)重组人胰岛素二结结晶溶解液的稀释浓度范围为5mg/ml。

10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤8)，所述pH为5.5-6.5，静置沉淀大于等于10小时，使用0.22μm的无菌滤芯进行过滤。