[发明专利]一种常见致病真菌感染检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于致病微生物检测技术领域，具体涉及一种常见致病真菌感染检测试剂盒。

背景技术

目前，真菌是接触性传染的重要病原体，是眼科角膜炎、皮肤科体癣、甲癣、脚气，妇科阴道感染、性病科生殖器感染、尿路感染的常见病原体。另外，近年来随着广谱抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂、抗肿瘤化疗药物等的广泛应用,以及器官移植的广泛开展,真菌感染发病率大大增加，如肺部感染、口腔感染、系统性感染。另外，真菌也是颅内感染的常见病原体。

真菌感染要么导致迁延不愈、给病人带来极大的痛苦或引起严重的并发症，如真菌导致的眼科角膜炎、皮肤科体癣、甲癣、脚气，妇科阴道感染、性病科生殖器感染、尿路感染，要么导致病人极高的死亡率，如北京协和医院2002年1月至2006年6月诊断的152例肺部真菌感染患者按照统一的定义进行重新分组:确诊组38例,临床诊断组24例,拟诊组35例,定植组55例,重新分析病原谱，临床诊断组病死率为58.3％,高于拟诊组(25.7％)和定植组(16.4％)[1]。造成迁延不愈、高死亡率的重要原因有，一是临床上诊断方法存在重大的缺陷，导致抗生素运用盲目，再就是有效的抗生素较少。

目前临床上常用的真菌感染的诊断方法有诸多重大缺陷。例如，依据临床症状诊断由于有极高的误诊率，影像学检查缺乏特异性，组织病理学检查因有创伤，这三种诊断方法也都无法确定致病真菌的菌属[2]。直接涂片法、真菌培养法也受检验者的经验影响而误诊，后者也由于一些真菌无法培养导致漏诊，再就是对罕见真菌无法诊断，较高比例的真菌不能确诊到种属。较新的诊断方法集中于几种常见真菌的抗原、代谢产物检测，如曲霉半乳甘露聚糖(GM)抗原、念珠菌热敏抗原、隐球菌荚膜多糖抗原，这些新方法仅能用于少数几种真菌的诊断。

目前，在分子诊断方面，如实时聚合酶链式反应(PCR)、多重PCR、基因芯片技术等灵敏度与特异度大幅提高，但也仅限于诊断已知致病真菌，并存在高比例的假阳性。

因此，需要研发出更快、更精确的真菌属种诊断方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种常见致病真菌感染检测试剂盒。

本发明的具体技术方案如下：

一种常见致病真菌感染检测试剂盒，包括用以进行PCR扩增的一组检测引物、双蒸水、2x PCR master mix、阳性对照基因组DNA，其中，该组检测引物包括一正向引物和一反向引物，各引物的浓度为100μM，分别如SEQ ID NO 01和SEQ ID NO 02所示；2x PCR master mix的配方为：Taq 0.1U/μL，dNTP各0.4mM，100mM KCl，3mM MgCl₂，20mM Tris-HCl，pH8.3；阳性对照基因组DNA的浓度为1ng/μL。

在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应体系的体积为50μL，具体如下：

进一步优选的，所述PCR扩增的程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，55.6℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；72℃延伸10min。

本发明的有益效果是：本发明运用18S rRNA测序来建立了一种简单、快速、精确的真菌性感染的致病真菌属种诊断方法，更精确地指导临床抗生素的应用，提高真菌性感染病人的预后，能快速诊断真菌性感染的常见致病真菌，为此类病人致病菌的快速诊断提供了可能，有助于降低此类感染的致死率和致残率。

附图说明

图1为本发明实施例3中PCR扩增反应条件测试后的电泳验证。退火温度47-58℃。

图2为本发明实施例中样品PCR扩增电泳。退火温度55.6℃。6、21、36未扩增出产物，未予测序。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步地说明和描述。

实施例1真菌基因组DNA的提取

参照DNeasy Plant Mini Kit(69104,QIAGEN,Germany)，步骤如下。

(1)取真菌样品(如阴道分泌物等)10μl加入600μl山梨醇buffer(1.2M)，加入大约5μl溶壁酶(10U/μl)，充分混匀，30℃裂解1-2h。

(2)加入400μl Buffer AP1和4μl RNaseA(10mg/ml)，漩涡震荡混匀并在65℃裂解10min，在裂解过程中上下颠倒混匀2-3次。