[发明专利]一种真核生物DNA的Hi‑C高通量测序建库方法

权利要求书

1.一种真核生物DNA的Hi-C高通量测序建库方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：首先对样品进行甲醛交联获得交联后的物料，对所述交联后物料进行内切酶酶切获得酶切后物料，用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行末端修复，获得末端修复后DNA，对所述末端修复后DNA进行DNA细胞核内环化获得内环化后物料，再对所述内环化后物料进行解交联和纯化获得DNA测序文库；

其中，DNA细胞核内环化步骤包括将末端修复后DNA与环化体系混合并在4-6℃孵育2-4h后在16-22℃下孵育4-6h获得内环化后物料；

其中，所述环化体系的组成成分包括：T4连接酶缓冲液、BSA、T4DNA连接酶以及选自PEG 4000和PEG 6000中的至少一种的聚乙二醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环化体系包括以下用量的各组分：

和水，水的用量使得所述环化体系的总量为7ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，末端修复步骤包括将所述酶切后物料与末端修复体系在37℃下接触孵育45-60min，末端修复体系包括：1μl 10mM dATP，1μl 10mM dGTP、1μl 10mM dTTP、1μl 10mM dCTP、18.4μl-25μl 0.4mM生物素-14和30U Klenow聚合酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述交联后物料进行除蛋白孵育，所述除蛋白孵育的步骤包括：将所述交联后物料与SDS溶液接触混合获得SDS终浓度为0.3％的除蛋白体系，在37℃下孵育0.8-1.2h，孵育结束后加Triton X-100至终浓度为2％，37℃震荡温浴0.8-1.2h。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述样品为植物组织、动物组织或白细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述样品为植物组织或动物组织，甲醛交联的步骤包括：在15-25℃下将样品与交联体系混合后在15-25℃下真空孵育10-40min进行甲醛交联，孵育结束后加入甘氨酸至终浓度为0.1M-0.2M，在真空下孵育4-6min后用液氮研磨成粉末获得组织样品；

其中，所述交联体系为以NIB缓冲液为基本缓冲液含有终浓度为0.1％-0.2％的巯基乙醇和1％-2％甲醛。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括细胞核提取步骤：将1g所述组织样品置于8-12ml预冷的含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液中，并在冰上缓慢震荡10-20min，利用孔径为22-25微米的滤膜过滤两次悬浮液，4℃下3000g离心10-20min，收集沉淀，沉淀用8-12ml含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液重悬后在4℃1900g离心4-6min，收集沉淀，再用1ml含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液重悬沉淀后在4℃1900g离心5min，收集细胞核；

其中，含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液中蛋白酶抑制剂的浓度为0.1mM-0.2mM。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述样品为白细胞，甲醛交联的步骤包括：

PBS重悬收集的白细胞，加入甲醛至终浓度为2％，15-25℃下颠倒混匀8-12min，加入甘氨酸至终浓度为0.1M-0.2M，孵育2-3min；3000rpm离心15-25min，收集沉淀；用2-6℃的PBS重悬沉淀一次，离心去上清，加入2-6℃的含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液重悬细胞，2-6℃孵育18-22min后5000rpm离心4-6min，弃去上清。

9.根据权利要求1、6-8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在纯化后将DNA破碎为300bp-700bp的片段获得打断产物，再对所述打断产物进行二次末端修复。