[发明专利]一种利用LAMP技术检测植物组织中茄科青枯菌的方法

权利要求书

1.一种利用LAMP技术检测植物组织中茄科青枯菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)环介导等温扩增茄科青枯菌引物设计：选取茄科青枯菌的特异基因hrpB，设计适合环介导等温扩增的引物FIP、F3、BIP、B3和环引物LoopF；

FIP：5’-CGCGTAGTCGTCGGACTTTCC-CCGTGCGTATCAGCTCGT-3’；

F3：5’-TTTCGCCGCTGATTTCGA-3’；

BIP：5’-AGTGCGATGAAGAAGCGGAAGA-CAGCTGGTCATCCGAATGG-3’；

B3：5’-CTGCCAGCCGGTATTGC-3’；

LoopF：5’-TCGCTGGGAGGAGTGGT-3’；

(2)检测病样品的准备：取待检病样的茎基部和根部，用水冲洗干净，取含有维管束的病组织；

(3)青枯菌悬浮液制备：用灭菌的镊子将步骤(2)中获取的病组织放入灭菌容器中，加入灭菌水，静置，得到待检病样品悬浮液；

(4)环介导等温扩增法反应：以步骤(3)获得的待检病样品悬浮液为模板，用步骤(1)的引物进行LAMP反应；

(5)鉴别结果：通过肉眼观察环介导等温扩增的反应产物，如反应产物为绿色的浑浊液体，即确认病样中含有茄科青枯菌；如反应产物为橙色透明液体，则表明病样不含有茄科青枯菌；

步骤(4)中所述的LAMP反应的反应条件为62℃恒温1h，95℃恒温2min。

2.根据权利要求1所述利用LAMP技术检测植物组织中茄科青枯菌的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的病组织的大小为2～3mm×3～4mm；

步骤(3)中所述的灭菌水的用量为大小为2～3mm×3～4mm的病组织配比500μL灭菌水。

3.根据权利要求1所述利用LAMP技术检测植物组织中茄科青枯菌的方法，其特征在于：所述的静置的时间为10～20分钟。

4.根据权利要求3所述利用LAMP技术检测植物组织中茄科青枯菌的方法，其特征在于：所述的静置的时间为15分钟。

5.根据权利要求1所述利用LAMP技术检测植物组织中茄科青枯菌的方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的LAMP反应的反应体系如下：每25μL反应体积中，含1μL待检病样品悬浮液、12.5μL 2×反应缓冲液、浓度为50μM的引物FIP和BIP各2μL、浓度为50μM的引物LoopF 1μL、浓度为50μM的引物F3和B3各0.5μL、Bst DN聚合酶1μL、荧光目测反应液1μL，去离子水补足至25μL；

所述的2×反应缓冲液的组成如下：40mM、pH8.8的Tris-HCl，浓度为20mM的KCl、浓度为16mM的MgSO₄、浓度为20mM的(NH₄)₂SO₄、浓度为体积百分比0.2％的Tween-20、浓度为1.6M的甜菜碱、浓度为2.8mM的dNTPs。

6.根据权利要求1所述利用LAMP技术检测植物组织中茄科青枯菌的方法，其特征在于：所述的植物为茄子、番茄、烟草、马铃薯、辣椒、花生、沙姜、生姜和甘薯中的一种以上。