[发明专利]一种对虾胚胎细胞的分离与培养方法

说明书

本发明建立一种有效的对虾胚胎细胞解离与培养技术，并将其应用于对虾胚胎细胞建系研究。本发明优化了对虾胚胎的无菌消毒处理技术，可直接从对虾育苗厂收集虾卵，运回实验室后处理，尤其是碘伏的处理浓度的优化，既保证有效控制微生物和原生动物的污染，又最大程度降低碘伏对胚胎的毒性；优化了对虾完全培养基的配方，为对虾胚胎细胞的贴壁和生长提供了更合适的营养条件，贴壁更快，生长更好，同时简化了培养基的配方，降低了培养基的成本；采用由适当孔径不锈钢滤网制作的胚胎细胞收集器，捣碎对虾胚胎的方法，可在短时间内获得大量活的胚胎细胞和细胞团，操作简便快速，仅用数秒，不易污染，效果远超已报道的其它解离方法。

技术领域

本发明属于动物细胞、组织培养技术领域，具体涉及一种对虾胚胎细胞的无菌分离与体外培养方法。

背景技术

对虾病毒病的频繁爆发已给对虾养殖业带来了沉重打击，成为制约对虾养殖业可持续发展的瓶颈问题。对虾永生化细胞系的建立可为对虾病毒的分离纯化、研究其致病机理、生产高效的抗病毒疫苗或药物等提供有效的研究手段和载体。虽然国内外专家学者在对虾细胞建系上进行了大量的探索和努力，但由于对虾成体组织来源的体外培养细胞不分裂，难以被转化，其永生化细胞系一直未能成功建立。而早期胚胎由于具有活跃增殖能力和多分化潜能，是对虾细胞建系的良好组织来源。但是，对虾受精卵为均黄卵，完全卵裂，其早期胚胎细胞的分离与培养困难，且极易污染，因而有关对虾胚胎细胞培养方面的研究报道很少。最早于1996年，童裳亮等、Toullec等和Frerichs分别报道了中国对虾、印度对虾和罗氏沼虾的胚胎细胞培养结果。童裳亮等在中国对虾胚胎细胞培养上的尝试因微生物和原生动物的严重污染而失败。Toullec等以印度对虾16-细胞期胚胎为材料，采用M199培养基和药物处理去除受精膜的解离方法，成功得到贴壁生长的原代培养胚胎细胞，但细胞单层只维持了2周。Frerichs以罗氏沼虾7-13天胚胎为材料，采用M199培养基和研磨法，也成功得到贴壁生长的原代培养胚胎细胞，但未形成连续性单层，并且机械法传代后，细胞不再贴壁。6年后，樊廷俊等(2002)采用添加了生长因子(bFGF和IGF-II)的MPS培养基和研磨法，培养得到了中国对虾胚胎细胞连续性单层，但未见后续建系成功的报道，其结果也没有被他人重复出来。7年后，余黎明等(2009)探索了中国明对虾囊胚和原肠胚细胞的解离和培养方法，发现解剖法适用于分离囊胚细胞，血球计数板压片法适于分离原肠胚细胞，所培养的胚胎细胞单层可体外维持1-5周，但未见明显增殖。解剖法和压片法操作起来效率很低，极易污染，而研磨法、过筛法和过针法均不能得到足够多的活细胞。可见，今后要实现对虾胚胎细胞的体外长期培养，以至建系成功，亟需建立有效的对虾胚胎细胞的解离与培养方法以及无菌操作技术。

发明内容

本发明的目的是建立一种有效的对虾胚胎细胞解离与培养技术，并将其应用于对虾胚胎细胞建系研究。

本发明首先提供一种对虾早期胚胎的清洗方法，具体步骤如下：用吸管收集对虾胚胎至离心管中，无菌海水洗涤5-6次，弃除死亡胚胎和杂质颗粒；将胚胎转移到70目不锈钢滤网中，淘洗数次后，流水连续冲洗1-2h，然后用10％碘伏处理5-10分钟，去除细菌和真菌等微生物的污染；75％酒精短暂漂洗20-30秒，去除碘伏；然后依次用添加有2000IU/mL青霉素和链霉素的无菌海水和PBS充分漂洗，去除酒精；最后暂存于对虾基础培养基中。

上述无菌海水的制备方法：天然海水依次经过16-20层纱布和0.22μm滤膜过滤后，高压蒸汽灭菌20分钟。

上述PBS溶液的配制方法：分别称取8.0g NaCl，0.2g KCl，3.0g Na₂HPO₄·12H₂O和0.2g的KH₂PO₄溶于1L纯水中，溶解，用3M NaOH调节pH值至7.2～7.4，121℃高压灭菌20分钟，分装后4℃保存备用。