[发明专利]抗草甘膦基因筛选方法、EPSPS突变基因和缺陷型菌株及应用

权利要求书

1.一种抗草甘膦基因筛选方法，其特征在于，其包括：

采用基因敲除技术敲除源菌株的干扰基因，得到缺陷型菌株，所述源菌株来自大肠杆菌DH5α、TOP10以及BL21中的一种，所述干扰基因包括功能不同的EPSPS基因和C-P Lyase基因，所述缺陷型菌株为EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株；先将外源EPSPS基因导入所述缺陷型菌株中，再经诱变处理后，得到含有外源EPSPS突变基因的第一突变菌，所述外源EPSPS基因来自目的植物；

或者先将所述外源EPSPS基因经突变处理，得到外源EPSPS突变基因，再将所述外源EPSPS突变基因导入所述缺陷型菌株，得到第二突变菌；

将所述第一突变菌或所述第二突变菌置于含有草甘膦的筛选培养基上进行筛选培养，得到具有草甘膦抗性的单克隆抗性菌；

对所述单克隆抗性菌进行测序验证，得到具有草甘膦抗性的EPSPS突变基因；

其中，敲除大肠杆菌的C-P Lyase基因的方法包括：将SEQ ID NO.16所示的核苷酸片段转入到大肠杆菌中，得到敲除C-P Lyase基因的大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的抗草甘膦基因筛选方法，其特征在于，所述诱变处理为化学诱变处理或辐射诱变处理。

3.根据权利要求1所述的抗草甘膦基因筛选方法，其特征在于，所述突变处理是以所述外源EPSPS基因为模板，采用错配PCR法或DNA Shuffling法进行PCR得到所述外源EPSPS突变基因。

4.根据权利要求1所述的抗草甘膦基因筛选方法，其特征在于，所述目的植物为水稻、大豆、小麦、玉米、大麦、高粱、烟草、棉花、甘薯、杨树、马铃薯、白菜、甘蓝或青椒。

5.一种具有草甘膦抗性的EPSPS突变基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示或如SEQ ID NO 10所示。

6.根据权利要求5所述的EPSPS突变基因在转化植物以使植物具有所述草甘膦抗性的应用。

7.一种缺陷型菌株，其特征在于，所述缺陷型菌株由源菌株经采用基因敲除技术敲除干扰基因后得到，所述干扰基因包括EPSPS基因和C-P Lyase基因，所述源菌株选自大肠杆菌DH5α、TOP10以及BL21中的一种，所述缺陷型菌株为EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株；

其中，敲除大肠杆菌的C-P Lyase基因的方法包括：将SEQ ID NO.16所示的核苷酸片段转入到大肠杆菌中，得到敲除C-P Lyase基因的大肠杆菌。

8.根据权利要求7所述的缺陷型菌株在测试来自目的植物的EPSPS基因的功能中的应用。

9.根据权利要求7所述的缺陷型菌株在测试来自目的植物的EPSPS基因对草甘膦的抗性中的应用。

10.根据权利要求7所述的缺陷型菌株在筛选具有草甘膦抗性的来自目的植物的EPSPS突变基因中的应用。