[发明专利]一种高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法

说明书

本发明公开了一种高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法，包括以下步骤：将需要进行筛选的霉菌菌株分别接种到霉菌生孢子培养基斜面上，然后恒温培养；在无菌干燥平皿中先倒入下层对照培养基，再倒入上层筛选培养基，再往制备好的双层平板中插入多个无菌小杯，制备得到高蛋白酶霉菌定向筛选平板；用已经培养好的待测霉菌孢子制成孢子悬液，并在孢子活化液体培养基中振荡活化培养；再分别注入前述的各无菌小杯中，恒温培养；培养完成后，直接量取高蛋白酶霉菌定向筛选平板上各透明圈直径；根据直径大小确定各霉菌菌株蛋白酶活力的大小，透明圈越大，霉菌菌株蛋白酶活力越大。本发明的方法具有方便操作、准确率高、工作量小及成本低等优点。

技术领域

本发明可用于发酵食品(酱油、豆豉、腐乳等)中优良发酵菌种的筛选，属于食品发酵技术领域，特别涉及一种高产蛋白酶霉菌菌株快速简便的筛选方法。

背景技术

霉菌中的米曲霉、毛霉等在发酵食品中应用广泛，其丰富的蛋白酶能将原料中的蛋白质降解成多肽及氨基酸，提高蛋白质的消化利用率；特别是能产生一些呈味氨基酸及小分子肽，赋予发酵食品良好的风味。可以说，米曲霉及毛霉等霉菌是发酵食品生产中的重要菌种。

酱油、豆豉、腐乳等发酵食品生产中所用的米曲霉、毛霉等菌种应具有较高的蛋白酶酶活，发酵食品生产中菌种的蛋白酶酶活直接影响了原料的利用率、氨基氮含量等重要指标，因此，筛选获得高蛋白酶活力的霉菌菌株对于酱油等发酵豆类食品生产尤为重要。

目前，常用的蛋白酶活力筛选方法为酪素平板法，通过测定菌株在平板上分泌蛋白酶产生的透明圈与菌落直径的比值(K值)来筛选高蛋白酶酶活菌株(参见图1)，从图1中可以看出，这种方法由于霉菌在生长过程中菌落形态不规则、边缘不清晰，透明圈直径较难测定，导致K值的测定结果准确度较低；且各菌之间的K值很小，难以反应各菌之间产酶能力的差距(参见图3)，从图3中可以看出实际测得的酶活大小与K值的大小相关性很差，这说明传统的琼脂-酪素双层平板法对曲霉的筛选结果不可靠。为准确进行筛选，不得不在制曲培养后采取福林-酚法进行蛋白酶酶活的测定。福林-酚法测定蛋白酶酶活需要采用三角瓶制曲、培养、绘制标准曲线，结果虽然准确，但器材及试剂药品用量大，而且所需时间长，方法繁琐，耗时耗力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种方便操作、准确率高、工作量小及成本低的高产蛋白酶霉菌菌株的快速筛选方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种高产蛋白酶霉菌菌株(特别优选米曲霉菌株或毛霉菌株)的快速筛选方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化：将需要进行筛选的多种或多株霉菌菌株分别接种于霉菌生孢子培养基斜面，然后恒温培养；

(2)制备高蛋白酶霉菌定向筛选平板：在灭菌干燥后的平皿中先倒入下层对照培养基，待其冷却凝固后再倒入上层筛选培养基；

(3)放置并固定筛选装置：在上层筛选培养基待凝过程中放置多个同等大小的无菌小杯，培养基凝固后无菌小杯固定；

(4)待测霉菌孢子悬液制备及活化：无菌生理盐水洗下步骤(1)中培养好的霉菌孢子，无菌擦镜纸过滤除菌丝后接入孢子活化液体培养基活化，再调整孢子浓度；

(5)待测霉菌测定前培养：等量吸取步骤(4)制备的各霉菌活化孢子悬液，分别注入上述步骤(2)制得的高蛋白酶霉菌定向筛选平板的各无菌小杯中(其中一个无菌小杯中可注入等量的无菌水作对照)，接种完成后置于恒温培养箱中培养；

(6)待测霉菌蛋白酶酶活对比筛选：上述步骤(5)的培养完成后，量取高蛋白酶霉菌定向筛选平板上各无菌小杯周围形成的透明圈直径；根据透明圈直径大小确定各霉菌菌株蛋白酶活力大小，透明圈越大，无菌小杯中接种的霉菌菌株蛋白酶活力越大。