[发明专利]一种基因Hdiv-SARP19-I1及其重组蛋白的抗菌应用

权利要求书

1.一种编码Hdiv-SARP19-I1蛋白的基因，其特征在于其核酸序列如序列表SEQ IDNo.1所示，其中碱基1～45位编码信号肽，46～453编码成熟的Hdiv-SARP19-I1蛋白，454～456位为终止密码子。

2.一种经过修饰的Hdiv-SARP19-I1基因，其特征在于其核酸序列如序列表SEQ IDNo.2所示，其中碱基1～42位引入了限制性内切酶EcoR I的酶切位点、组氨酸纯化标签和肠激酶标签，43～450位为Hdiv-SARP19-I1蛋白去除信号肽后的编码区，451～453为终止密码子，454～461为限制性内切酶Not I的酶切位点。

3.一种Hdiv-SARP19-I1蛋白，其特征在于其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。

4.一种由毕赤酵母分泌表达的Hdiv-SARP19-I1重组蛋白，其特征在于如序列表SEQ IDNo.4所示，其中1～20位点为融合部分，包含组氨酸纯化标签和肠激酶标签，21～156位点为去除信号肽的Hdiv-SARP19-I1蛋白。

5.一种由权利要求4所述的Hdiv-SARP19-I1重组蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)表达载体的构建：将合成的目的基因和载体pPIC9.0K用限制性内切酶EcoR I和NotI进行双酶切，酶切后产物进行琼脂糖电泳并用胶回收试剂盒回收DNA片段并连接；将连接产物加入感受态大肠杆菌TOP10中，热激转化，在LB液体培养基培养1h，将菌液涂布在含Zeocin的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜；从长好的平板上随机挑取若干生长状况良好的单克隆菌落，接种在含Zeocin的LB液体培养基培养过夜，用质粒提取试剂盒提取重组质粒，用限制性内切酶EcoRI和NotI对重组质粒进行双酶切，电泳验证基因片段正确插入，该重组质粒命名为pPIC9.0K-SARP19；

2)酵母表达系统的构建：利用限制性内切酶KpnI将重组质粒pPIC9.0K-SARP19线性化，用PCR产物纯化试剂盒回收线性化的pPIC9.0K-SARP19，加入感受态毕赤酵母中，电击转化，转化后的菌液涂布含Zeocin的YPD固体培养基上，30℃培养2～3天，在转化平板上选取生长良好的单克隆作为阳性转化子，挑选阳性克隆利用含遗传霉素的YPD平板培养72h，挑选能在高浓度遗传霉素下长势良好的菌株为高拷贝菌株，再将高拷贝菌株分别在MD、MM琼脂板上划线，培养2天后观察，在两种平板都能正常生长的是所要的Mut+转化子；

3)诱导表达：挑选高拷贝的Mut+转化子在YPD液体培养基中培养至OD600达6.0，离心收集菌体；用BMGY液体培养基重悬菌体，于28℃培养至OD600＝3.0，离心收集菌体；用BMGY液体培养基重悬菌体，于28℃290rpm培养96h，每24h向剩余的发酵液中补加甲醇溶液使甲醇终浓度1％；96h将发酵液离心收集上清，用SDS-PAGE检测；

4)目的蛋白的纯化和活性检测：

(1)先用PALL Centramate超滤系统的MWCO30K膜包过滤发酵上清液，收集滤过液，再用MWCO1K膜包滤膜过滤上一步的滤过液，收集截留液，将表达上清液浓缩20倍，过滤过程中每过1h往样品中添加PMSF溶液防止蛋白分解；

(2)目的蛋白带有组氨酸标签，采用结合镍的Chelating Sepharose Fast Flow填料纯化；

(3)采用抑菌圈法检测目的蛋白的抗菌活性。

6.一种由权利要求4所述的Hdiv-SARP19-I1重组蛋白在制备拮抗肺炎克雷伯氏菌的蛋白类药物中应用。

7.一种由权利要求4所述的Hdiv-SARP19-I1重组蛋白在制备拮抗肺炎克雷伯氏菌的杀菌剂中应用。