[发明专利]一种牙鲆微卫星标记Paraoliva-2的基因型检测引物和方法

说明书

本发明公开了一种牙鲆微卫星标记Paraoliva‑2的基因型检测引物和方法。首先提取牙鲆肌肉中的基因组DNA并稀释备用；再利用牙鲆DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对牙鲆不同地理群或牙鲆群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得牙鲆的遗传多态性图谱。本发明可快捷的获得牙鲆遗传标记Paraoliva‑2的遗传变异图谱，方法简便。

技术领域

本发明属于牙鲆（Paralichthys olivaceus）DNA分子遗传标记技术，涉及一种检测牙鲆微卫星标记Paraoliva-2的技术方法，具体是牙鲆微卫星标记Paraoliva-2的基因型检测方法。

背景技术

牙鲆(Paralichthys olivaceus)属于鲽形目（Pleuronectiformes）、牙鲆科（Paralichthyidae）、牙鲆属(Paralichthys)，在我国称之为比目鱼（Flatfish, Fluke），左鲆（Left-eyed flounder）牙片和偏口（Plaice），是冷水性、底栖的海产名贵经济鱼类。在我国的渤海、黄海以及东海有广泛的分布。牙鲆具有生长快，个体大，繁殖力强，洄游性小，回归性强等特点，特别适宜于在沿海发展增养殖业。我国从80年代开始牙鲆的人工育苗和商品养殖，目前已在海水养殖中占有重要地位。然而，近年来过度捕捞已使其资源量严重衰减，而增养殖业的迅猛发展，也对牙鲜自然群体的遗传本质、种质资源和遗传多样性产生了不可低估的影响。分子标记可以应用于牙鲆的遗传多样性分析、个体识别和系谱认证等方面。虽然同工酶标记、RAPD标记及AFLP标记技术也可以用于研究牙鲆的遗传结构及其遗传多样性，然而由于这些标记都属于显性遗传标记，检测效率不如微卫星标记等共显性标记高。另外，同工酶标记的缺点是多态性低， RAPD标记的稳定性不好，AFLP标记操作繁琐，这些都大大限制了它们的应用。而微卫星序列广泛分布于真核生物基因组中，其特点是种类多，等位基因数目多，多态性高，共显性，孟德尔遗传方式，并随机分布于基因组中，而且微卫星标记检测效率高，结果稳定。当前，虽然牙鲆中已经开发了一些微卫星标记，但他们的缺点是等位基因少，多态性不高，限制了其应用，所以迫切需要获取高多态性的微卫星标记以进行牙鲆遗传多样性、个体识别和系谱认证等方面的研究和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种高多态性的牙鲆DNA分子遗传标记技术，即牙鲆微卫星标记Paraoliva-2的快速检测方法，以弥补已有技术的不足。

本发明的基本构思主要是利用牙鲆DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其两端设计特异性引物并进行PCR检测，从而快速地检测牙鲆每个个体在此微卫星区的遗传变异，获得该引物（微卫星标记Paraoliva-2）对牙鲆的多态性图谱，通过图谱直观地检测出每个个体的基因型。基于上述背景现状和实际要求，本发明从牙鲆DNA序列中获取了一个微卫星标记，命名为Paraoliva-2，该微卫星标记Paraoliva-2可用于牙鲆遗传多样性分析和系谱认证。

本发明是按照以下操作技术方案完成的：首先提取牙鲆肌肉中的基因组DNA并稀释备用；再利用牙鲆基因组DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对牙鲆不同地理群或牙鲆群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而确定每个个体的基因型，获得牙鲆的遗传多态性图谱。

提取牙鲆基因组DNA，将其稀释为100ng/μl，每个PCR反应中加入1μl，反应总体积为25μl。

含有微卫星序列的DNA序列为：

1 ccacatgtat gtatttgtca gggagtagta ggtttgctta cattcaatac aaacaatatg