[发明专利]一种硫解酶和编码基因及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种硫解酶的基因序列及其制备方法。本发明提供了该硫解酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)和羟脂肪酸方面的应用。本发明提供的硫解酶可广泛应用于农业、食品、医药及环保等领域。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，缩写为PHAs)是微生物合成的一类聚酯(PHB是PHA的一种)，由于其具有优良性质，如生物可降解性、生物相容性和光学性能等，有很广泛的用途。生物可降解性和热加工性使得其可制作塑料袋，农用地膜及农用除草剂、杀虫剂、肥料的载体，提高它们的利用效率而不会产生环境污染。生物相容性使得其可用作医用植入材料，药物载体，可调节药物的释放速率。手性药物：其手性单体(R型)可以作为手性药物或者手性药物合成的中间体。良好的气体相隔性使得其可用作食品等的包装材料。此外PHA还可用于生产生物能源，具有可燃性，经甲酯化处理以后，可直接作为生物燃料，只比柴油的燃烧热低15％左右。由于其具有这些优良特性，所以现已吸引了科技界和工业界的广泛兴趣。

羟脂肪酸是一种常见的药物以及其他很多化合物的合成中间体，可以以此为基础合成很多药物以及化合物。

β-酮基硫解酶(PhaA)是PHA合成代谢途径中的一个关键酶，在Ralstonia eutropha中的这个酶研究较为详细，测定了酶活以及动力学特性，确定了活性中心以及做过定点突变等工作，将该酶与其它两个酶一起在大肠杆菌或者毕赤酵母中构建了PHA代谢途径，产量也比较高，还通过添加不同底物的方式改变PHA的组成特性以生产具有某些特殊性能的PHA，在Ralstonia eutropha中，基本上相关的方面都已经研究过了，但是在其它种属中研究的很少，也很肤浅，在Methylobacterium菌属中只是确认了在该菌属中存在着这种酶，没有异源表达，也没有详细的测过酶活以及动力学特性。由于有机试剂对很多酶有较强的抑制作用，容易使酶的高级结构发生变化而变性失活，而Methylobacterium可以在甲醇培养液中生长，所以来源于Methylobacterium中的该酶应该对对机试剂具有一定的耐受性，这也是其它来源的这个酶可能不具有的特性。我们研究了在Methylobacterium sp.中该酶的活力大小以及动力学特性，更好地认识和利用了该酶。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的硫解酶PhaA及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型硫解酶PhaA的方法。

本发明的第三个目的是提供含有所述的硫解酶PhaA基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的第四个目的是提供一种新型硫解酶PhaA合成PHA中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种新型硫解酶PhaA在生产羟脂肪酸方面的应用。

本发明所提供的硫解酶PhaA，来源于土壤中甲基杆菌属(Methylobacterium sp.在中国北纳菌种保藏中心的资源编号为：BNCC195932)，从中扩增出的硫解酶PhaA编码基因(命名为phaA)，具有下述核苷酸序列特征之一：

1)序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码硫解酶活性蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

4)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有硫解酶活性的核苷酸序列。

本发明还提供了硫解酶PhaA的氨基酸序列，具有如下特征之一：

1)序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-396为具有活性硫解PhaA的氨基酸序列，397-402为His-Tag的氨基酸序列。

2)将序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-396位氨基酸残基进行一个或多个氨基酸取代、缺失或添加而形成具有硫解酶活性不变的氨基酸序列。

本发明的硫解酶PhaA的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的PhaA的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶PhaA的方法，是将编码基因PhaA克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的硫解酶。