[发明专利]一种鉴别胰岛素单体或胰岛素多聚体的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴别胰岛素单体或胰岛素多聚体的方法，同时建立了一种含锌胰岛素多聚体解聚为稳定单体的方法。具体而言涉及一种使用差示扫描量热法检测胰岛素单体或胰岛素多聚体的方法。本发明的鉴别方法，样品不需要进行标记或使用人造探针等复杂的样品预处理过程，具有操作简便，快速、灵敏度高等特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴别胰岛素单体或胰岛素多聚体的方法，同时建立了一种含锌胰岛素多聚体解聚为稳定单体的方法。

背景技术

糖尿病是一类与胰岛素产生和作用异常相关、以血糖增高(高糖血症)为特征的慢性疾病群，对人体造成极大的危害，它的并发症几乎波及人体的所有组织和器官，尤其是心脏、血管、神经末梢、眼睛和肾脏，是导致中风、心脏病、肾病、失明及截肢的主要原因之一。2015年12月1日IDF在世界糖尿病大会上发布的《糖尿病地图》显示，全球范围内，每11名成年人就有1人患有糖尿病(总计4.15亿)，II型糖尿病不再只是发达国家的专利，随着城市化进程的加剧以及饮食和生活方式的改变，IDF估计75％的糖尿病人群生活在中低收入国家。其中中国约有1.1亿名糖尿病患者，约占中国成年人总数的1/10。预计中国该数字将在2040年增至1.5亿人，给民众健康和社会经济带来严重影响。目前，每6秒钟就有1人因糖尿病死亡，年死亡率已经超过了疟疾、结核和艾滋病的总和。因此，胰岛素类药物作为糖尿病的主要治疗药物，应加快研发进度，尤其是生物类似药的研发。

差示扫描量热法(DSC)是指在程序升温时，将待测物与参比物置于等同的温度条件下，建立两者之间无温差条件所需供给的能量对时间或温度记录的一种方法。温度变化会引起生物大分子特定空间构象的改变，进而发生热容变化，而差示扫描微量热法可以直接测定溶液的热容变化，并获得相关的热力学参数，因其灵敏度高、快速可靠、可定量热分析、操作简便等特点，已广泛用于药物发现和开发，例如，用于鉴定和选择生物治疗药物开发过程中最稳定的蛋白质或潜在候选药物；用于配体相互作用研究；用于纯化和生产条件的快速优化；用于简易、快速确定液体制剂的最佳条件；对用于筛选的靶蛋白进行快速稳定性指示分析等。然而，差示扫描量热法用于胰岛素单体或胰岛素多聚体的鉴别未见报道。

发明内容

本发明涉及一种鉴别胰岛素单体或胰岛素多聚体的方法，其特征在于，使用差示扫描量热法检测含有胰岛素的溶液，并获得相应的DSC图谱，图谱中若出现明显吸热峰则该胰岛素以多聚体形式存在，图谱中若无吸热峰则该胰岛素以单体形式存在。

在本发明的一个实施方案中，所述胰岛素包括人胰岛素、胰岛素类似物等。优选的，所述胰岛素选自德谷胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、谷赖胰岛素、甘精胰岛素或地特胰岛素。更优选的，所述胰岛素选自德谷胰岛素或门冬胰岛素。

在本发明的一个实施方案中，所述多聚体选自六聚体或双六聚体。

在本发明的一个实施方案中，上述含有胰岛素的溶液，其特征在于，胰岛素最终浓度为0.05-1.50mmol/L，优选的浓度为0.1-1.0mmol/L，更优选的浓度为0.2-0.7mmol/L。

在本发明的一个实施方案中，上述含有胰岛素的溶液，进一步包括制备稳定的胰岛素单体溶液，其特征在于，含锌胰岛素制剂中加入EDTA，再加入柠檬酸钠缓冲液作为缓冲体系；上述EDTA和含锌胰岛素制剂的摩尔比范围选自10-0.5:1，优选8-2:1，最优选4:1；上述柠檬酸缓冲液的pH范围选自5.0-7.0，优选6.5；柠檬酸缓冲液的浓度选自10mmol/L-100mmol/L，优选20mmol/L-50mmol/L。

在本发明的一个实施方案中，上述所用差示扫描微量热仪的仪器型号为MicroCalVP-Capillary DSC，所述检测的起始温度为20℃，终止温度为110℃；升温速率为220℃/Hr.；保护气体为氮气，压力50-60psi；具体仪器参数如下：