[发明专利]一种快速无创检测EML4‑ALK融合基因的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一种用于快速无创检测EML4-ALK融合基因的引物组、试剂盒、方法及其应用。

背景技术

肺癌是最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率居恶性肿瘤的首位。近50年来，世界各国特别是工业发达国家，肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确，医学统计学表明肺癌的致病因素主要为吸烟，80％的男性肺癌和75％的女性肺癌是由吸烟造成的，此外与电离辐射、多环性芳香化合物、镍、铬、砷等工业致癌物的接触，种族、家属史对肺癌均有影响。

肺癌分为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)，NSCLC包括鳞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌、类癌等，占肺癌的85％。NSCLC的治疗包括手术、化疗、放疗、分子靶向治疗及生物免疫治疗等多种方法。肺癌初次诊断时约70％已属晚期，预后较差。晚期肺癌的主要治疗方法是全身化疗和靶向治疗，以及局部放射治疗。靶向治疗以其符合生理、低毒和理论上高效的特点，已成为最受关注和最有前途的治疗手段之一。与化疗不同，靶向治疗患者的肿瘤组织必须带有某种特异的基因或者蛋白(统称为靶点)，并且这种特异的靶点与肺癌的生长关系密切。

ALK是一种间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)，2007年发现在肺癌患者中由于染色体倒位形成棘皮动物微管相关类蛋白4(Echinoderm microtubule-associated protein-like 4,EML4)基因与ALK基因的融合(EML4-ALK)，使ALK酶组成型活化，促使肺癌发生和进展。EML4-ALK融合基因可能存在于包括肺癌在内的多种实体瘤中，但在NSCLC的检出率最高，同时因其与EGFR突变、K-ras突变的不共存现象以及含有EML4-ALK融合基因患者的鲜明临床特征，提示该靶点是肺腺癌特异性较高的分子标记物。EML4-ALK融合基因(又叫ALK阳性)的发现定义了NSCLC 的一个新亚型，堪称近年来NSCLC研究史上一个里程碑式的事件。目前，已至少发现了14种EML4-ALK的变异亚型。这些变异亚型均为EML4的不同外显子与ALK的20外显子相融合。亚型1(V1)，为EML4的第13外显子与ALK的第20外显子相连；亚型2(V2)，为EML4的第20外显子与ALK的第20外显子相连；亚型3(V3)，有两个亚亚型(V3a/b)，V3a为EML4的第6外显子与ALK的第20外显子相连，而V3b为EML4的第6外显子加上一个33bp的小片段再与ALK的第20外显子相连；亚型4(V4)，为EML4的第14外显子加上一个11bp的小片段再与前面缺失49bp的ALK的第20外显子相连；亚型5(V5)，有两个亚亚型(V5a/b)，V5a为EML4的第2外显子与ALK的第20外显子相连，而V3b为EML4的第2外显子加上一个117bp的小片段再与ALK的第20外显子相连；亚型6(V6)，为EML4的第13外显子加上一个49bp的小片段再与ALK的第20外显子相连；亚型7(V7)，为EML4的第14外显子与前面缺失12bp的ALK的第20外显子相连；亚型8(“V4”)，为EML4的第15外显子缺失了后面19bp再与前面缺失20bp的ALK的第20外显子相连；亚型9(“V5”)，为EML4的第18外显子与ALK的第20外显子相连。最常见的融合基因为亚型1，其次为亚型3。所有这些融合基因均具有生物学功能，表达的产物为一种嵌合型络氨酸激酶，可激活ALK基因的膜内催化区域，激活相关信号通路，促进细胞增殖、存活、迁移，达到细胞癌变的效果。

自融合基因发现以来，为寻找更简便和更准确的方法，研究人员做了各方面大量的研究。目前用于ALK融合基因的检测方法主要有荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)和逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)等。