[发明专利]一种多肽修饰的金纳米簇及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于功能性生物纳米材料技术领域，具体涉及一种多肽修饰的金纳米簇及其制备方法，采用KRKC和GSH两种多肽作为稳定剂修饰，通过设计多肽序列保证金属团簇的稳定性制备对细胞核仁具有靶向标记作用的红色荧光金纳米簇。

背景技术：

细胞核仁是细胞核内的重要亚核结构，对于细胞的生长、增殖都有重要作用。除此之外，核仁还是细胞核内rRNA转录、翻译以及核糖体组装的场所，因此又被称为“核糖体工厂”，甚至有文献报道核仁也是某些病毒的靶向攻击位置。细胞核仁并不是一直存在的，它形成于细胞分裂间期，由熔融态的核仁物质聚集形成，目前对于细胞核仁的生物学作用的研究尚不成熟。研究核仁及其相关过程时，非常重要的步骤是对核仁进行标记将核仁可视化。目前，对于核仁的可视化方法，得到普遍认同的有①银染法—通过AgNO₃与细胞核仁处的酸性蛋白反应，实现银的还原，生成黑色银颗粒，进而对核仁位置进行标记，缺点是在光学显微镜下呈黑色且无荧光信号，不利于进一步的研究使用；②商业化的STYO染料染色法---在480nm激发下有500nm的荧光发射，并且染料分子与RNA结合后荧光强度会存在数量级的变化，但染料分子的结构没有公开报道。

近年来，随着研究的不断深入，对核仁特异性染色的其他材料也相应进入人们的视线，如以稀土元素铕为配位中心构成的稀土配合物；以吡啶，吡咯及苯等芳环结构构成的超低分子量的荧光探针；以及由过渡金属元素锇、铱组成的异核双配位化合物均可对细胞核仁进行特异性的标记。这类材料的共同特征就是表面含有大量的芳环结构，可能是对核仁进行靶向识别的作用基团。越来越多的荧光纳米材料应用于荧光标记领域，与传统的化学染料相比，荧光纳米材料的抗光漂白性更好，并且通过对纳米材料表面进行修饰，还会使得材料的生物亲和性大大提高。通过调节纳米材料的尺寸可以得到发射波长较长的材料，这对降低细胞成像的背景干扰，信噪比及细胞自荧光都是有利的。

金属团簇纳米材料具有超小的颗粒尺寸具有优良的荧光性，将其负载在对细胞核内组分具有靶向材料的载体上可以进入细胞核的双层膜结构，同时荧光标记细胞核仁结构，多肽序列具有比抗体更优良的靶向特异性，设计合理有效的多肽序列，合成可对细胞核仁靶向标记的纳米金簇为研究细胞核仁及其相关过程提供更好的帮助。

发明内容：

本发明目的在于克服现有技术的不足，寻求一种多肽修饰的标记细胞核仁的金纳米簇及其制备方法用，降低现有细胞核仁标记材料细胞成像的背景干扰以及解决现有细胞核仁标记材料制作成本高、毒性大和制作工艺复杂的问题。

为了实现上述目的，本发明涉及的多肽修饰的金纳米簇的制备方法，具体工艺步骤如下：

(1)用超纯水分别配置20mmol/L的HAuCl₄、20mmol/L的KRKC和20mmol/L的GSH溶液，将玻璃瓶用王水浸泡处理，清洗干净后烘干备用；

(2)向处理好的玻璃瓶内先加入450μL的KRKC溶液及150μL的GSH溶液混合均匀，再向其中加入HAuCl₄溶液300μL，可观察到反应体系颜色由无色变为淡黄色，最后向玻璃瓶中加入超纯水使溶液中Au⁺的终浓度为2mmol/L；

(3)将加入反应物的玻璃瓶放置于恒温水浴锅内,70℃-80℃恒温反应12h；

(4)反应结束后，将样品转移到离心管中离心除去大分子颗粒物质，将离心上清液中剩余的未反应原料及小分子物质除去得到金纳米簇；

步骤(4)中离心上清液采用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜过滤，或采用透析或外加甲醇、乙醇和丙酮中的任一种离心沉降处理得到金纳米簇；所述KRKC的中文全称为赖氨酸--精氨酸--赖氨酸--半胱氨酸，所述GSH的中文全称为谷氨酸--半胱氨酸--甘氨酸。

上述方法制备的多肽修饰的金纳米簇，其粒径为1.5-2.8nm范围内，平均颗粒直径为1.9nm，金纳米簇在400nm附近有明显的吸收峰，当用400nm的激发光对金纳米簇照射时，在500-750nm区间有较强的荧光发射，发射峰在586nm附近，金纳米簇的荧光量子产率为7％。

与现有技术相比，本发明涉及的多肽修饰的金纳米簇的合成方法简单，操作性强，成本低，材料表面用多肽稳定，生物亲和性好，采用多肽多为稳定剂毒性低，稳定性好，发射波长，利于得到更好的核仁成像效果，此外，合成的纳米材料对细胞核仁有特异性标记，相对于比较常规的富芳环的荧光探针，这是一种全新的材料，为核仁的研究提供了新的思路与方法。

附图说明：