[发明专利]一种蛋白质O-GlcNAc糖基转移酶活性电化学传感检测方法

说明书

本发明公开了一种蛋白质O‑GlcNAc糖基转移酶活性的电化学传感检测方法。它包括如下步骤：在电极表面构筑OGT的底物多肽分子的膜；将得到的表面固定有多肽分子的膜的电极与糖基化反应液采用OGT催化进行共孵育，得到表面固定有糖基化多肽分子的膜的电极；将表面固定有多肽分子的膜的电极和表面固定有糖基化多肽分子的膜的电极分别依次进行1)‑3)的处理，1)置于蛋白酶反应液中水解；2)用水清洗电极；3)以酪氨酸残基作为电化学信号探针，将电极进行电化学氧化反应；得到的体系分别测定各自体系中酪氨酸残基电催化氧化电流，根据得到的催化氧化电流，即可定量分析OGT的活性。本发明简单、快速、免标记的电化学生物传感器检测OGT活性的方法。

技术领域

本发明涉及一种蛋白质O-GlcNAc糖基转移酶活性的电化学传感检测方法，属于生物分析领域。

背景技术

蛋白质糖基化是蛋白质翻译后修饰中最常见、最重要的一种共价修饰方式，是蛋白质功能的一种重要调节机制，它涉及细胞免疫、信号传导、蛋白翻译调控、蛋白降解等诸多生物过程(Wong C.H.J.Org.Chem.,2005,70(11):4219-4225.)。作为一种普遍存在的翻译后修饰，糖基化对蛋白质的结构和功能有着重要影响。在生物体中50％以上的蛋白质存在糖基化现象(Apweiler R.et al.Biochim.Biophys.Acta,1999,1473(1):4-8.)，糖基化对于蛋白质的折叠、运输、定位起着重要作用(Helenius A.Science,2001,291(5512):2364-2369.)，免疫系统中几乎所有的关键分子都是糖蛋白(Rudd P.M.et al.Science,2001,291(5512):2370-2376.)。糖基化异常会导致疾病的发生。在帕金森病、风湿性关节炎和其他与自由基相关的疾病患者体内，检测到铁转移蛋白糖基化水平异常，铁转移蛋白是一种糖基化的金属转运血清蛋白，糖基化稳定了铁转移蛋白，间接地调节了铁离子的平衡(van Rensburg S.J.et al.Metab.Brain Dis.,2004,19(1-2):89-96.)。另有文献报道糖基化的紊乱与肌营养不良症相关，Muntoni F等通过对糖基转移酶活性的鉴定，发现导致肌肉营养失调的新机制，在所有病例中，普遍存在着肌营养不良蛋白糖基化异常(MuntoniF.et al.Curr.Opin.Neurol.,2004,17(2):205-209.)。蛋白质糖基化是由糖基转移酶催化的低聚糖以糖苷的形式与蛋白质上特定的氨基酸残基共价结合的过程，糖基化形成的糖蛋白分子中的糖残基一般有2～10个，涉及到的单糖种类主要有葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、甘露糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、岩藻糖、N-乙酰神经氨酸等。蛋白质糖基化按照氨基酸和糖的连接方式主要分为两大类：N位糖基化和O位糖基化。N位糖基化是在内质网上由糖基转移酶催化，在内分泌蛋白和膜结合蛋白的天冬酰胺残基的氨基上结合寡糖的过程。普遍认为N位糖基化发生在蛋白特定氨基酸序列Asn-X-Ser/Thr(X为除脯氨酸以外的任何氨基酸)上。O位糖基化多发生在丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基的羟基位点上，糖基化位点处的蛋白多为β构型，O位低聚糖以逐步加接单糖的形式形成，目前没有发现特异的氨基酸序列作为O位糖基化位点。其中，O位糖基化形式在生物体内分布最广。在哺乳动物体内最常见的O位糖基化形式是O-GalNAc和O-GlcNAc。O-GalNAc糖基化是由N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAc-T)催化N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)结合到蛋白质Ser或Thr的羟基位点上。ppGalNAc-T是一个酶家族，表达产物均为II型膜蛋白ppGalNAc-T酶家族作为催化O位糖基化起始的糖基转移酶，已有文献报道它在肿瘤的发生、转移等过程中起着重要作用，且与某些重大疾病密切相关。O-GlcNAc则是由N-乙酰氨基葡萄糖转移酶催化N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)结合到蛋白质Ser或Thr残基上。O-GlcNAc是单糖修饰，不能被进一步延长。已有文献报道O-GlcNAc糖基化与信号传导有密切关系(Wells L.et al.Science,2001,291(5512):2376-2378.)。O-GlcNAc糖基化从构象上分为两类：O-α-GlcNAc和O-β-GlcNAc，且此糖基化过程可逆。它主要有三个特征：糖基化位点与蛋白激酶作用位点相似；糖基化与磷酸化相互抑制，对很多蛋白有去磷酸化作用；O-GlcNAc糖基化高度动态，对细胞信号等能做出快速反应。目前研究表明，O-GlcNAc修饰的蛋白质超过1000多种，分布在细胞质和细胞核，生物体内蛋白质的O-GlcNA糖基化，赋予了蛋白质不同的生物学功能(Hart G.W.etal.Nature,2007,446(7139):1017-1022.)，如参与信号转导、参与基因转录与翻译、调节细胞周期、介导应激反应通路等。并且O-GlcNAc调节紊乱将引起糖尿病、神经退行性疾病、心血管疾病以及肿瘤(如乳腺癌、肺癌)等的发生。基于糖基化在生物体内的重要作用，以糖基化作为治疗靶点的药物也相继问世，治疗机制是对相应的酶进行调节(Dwek R.A.etal.Nat.Rev.Drug Discov.,2002,1(1):65-75.)。