[发明专利]一种HMGR基因mRNA在梨属砧穗间传递的分子鉴定方法

说明书

本发明公开了HMGR基因mRNA在梨属砧穗间传递的分子鉴定方法，包括如下步骤：(1)鸭梨为接穗，杜梨为砧木进行试管苗微嫁接；(2)分别提取杜梨、鸭梨以及嫁接后砧木与接穗的总RNA，反转录成cDNA，PCR扩增HMGR基因的全长，以此为模板进行第二次PCR，得到各自的HMGR基因片段；两次PCR的上下游引物序列分别如SEQ ID NO.1‑4所示；(3)限制性内切酶对第二次PCR产物进行酶切，比较嫁接前后的酶切谱图鉴定传递情况。本发明提供的方法快速、灵敏，准确性高，简便，能够应用于其他梨属植物。

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及的是HMGR基因mRNA分子在梨属植物砧木和接穗间长距离传递的分子鉴定方法。

背景技术

在园艺作物生产实践过程中，应用嫁接技术可以提高植株抗性、增加产量、改善果实品质，对品种的改良，经济价值的提高都有着非常重要的意义，其中在果树生产上嫁接更是得到了广泛运用。在果树生产上发现，不同砧木对接穗的生理生化特性、开花结实、环境的适应能力以及树体生长发育等方面能产生不同的影响，而这些影响最终会对果品的形成以及后期的经济价值起到关键性的作用。

到目前为止，已经发现砧穗间存在许多通过植物韧皮部远距离传递的內源mRNA分子，长距离传递mRNA信号能够由砧木传递到接穗，进而影响接穗生理和发育进程。因此，通过对果树砧穗间长距离传递mRNA分子进行鉴定和机理研究，可以为mRNA在多年生木本植物远距离传递机理以及砧穗间互作机理研究提供理论基础，也可利用可传递mRNA开发一种可以定向改良接穗性状的新型砧木育种方法，进而达到通过嫁接调控接穗性状，避免转基因果品，而获得优良果实品质，提高经济效益，为今后果树育种及生产提供指导。

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是甲羟戊酸途径中合成萜类物质的第一个重要限速酶，是细胞质萜类化合物代谢中的重要调控位点(Bach,1986；Choi et al.,1992)，在植物的生长发育过程中起到非常重要的作用。在植物中HMGR多肽链部分都是由N-末端区、连接区、跨膜区和C-末端区这四部分组成，其中C-末端催化区域由基因中的近3’端编码形成，且在多数植物中高度保守(Roberts,2007)。在目前所报道的植物中，HMGR多由一个基因家族编码，且不同植物中同源基因的数目是不同的。拟南芥中已经克隆得到4个同源基因(Caelles et al.,1989；Lin et al.,1999；Theologis et al.,2000)，在苹果中至少有2个不同基因能编码HMGR，分别为MdHMG1和MdHMG2(Rupasinghe et al.,2001)，沙梨在NCBI中登录编码HMGR基因有2个，梨属的杜梨PbHMGR1也被克隆得到(黄晶等，2015)。