[发明专利]一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法及其应用

权利要求书

1.一种利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）失活酵母菌粉的制备：将产朊假丝酵母 (Candida utilis) CICC1769接种液体培养基中培养，离心得到的菌泥用蒸馏水洗涤，以高压蒸汽灭菌法灭活，然后在-22～-18℃下的预冷8-16h，之后再将预冷的冷冻菌泥放入冷冻干燥机进行干燥，设置温度为-56～-52℃，真空度4-6mtorr，时间20-30h，冷冻干燥完成之后，得到失活酵母菌粉，备用；

（2）Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备：按摩尔比（1.6-2.0）：1称取氯化铁和氯化亚铁，溶解在蒸馏水中，通入氮气除氧后备用；在装有搅拌器、冷凝管、N₂保护的容器中，加入盐酸和PEG-2000，控制温度33-36 ℃，搅拌并N₂保护条件下，快速加入氨水，滴加至pH为9-9.5，搅拌10-30 min后于水浴恒温70 ℃熟化20-40 min，降温至室温，用无水乙醇反复洗涤，分离，干燥，得到Fe₃O₄磁性纳米粒子，备用；

（3）磁性Fe₃O₄/CTS微球的制备：称取Fe₃O₄磁性纳米粒子于容器中，加入溶解有壳聚糖的体积分数为5%的乙酸溶液，Fe₃O₄磁性纳米粒子与壳聚糖的质量比为1：1，再加入液体石蜡、span-80，超声分散后，加入戊二醛溶液，机械搅拌反应2-4h，反应完成后用石油醚充分洗涤，并用丙酮洗涤脱水，于真空干燥箱中干燥，研磨成流动粉末，得到磁性Fe₃O₄/CTS微球，备用；

（4）固定化失活产朊假丝酵母(Candida utilis) CICC1769细胞的磁性微球的制备：取磁性Fe₃O₄/CTS微球在超纯水中溶胀10-15h后，加入步骤（1）制备的失活酵母菌粉，调pH=6，25-35 ℃下固定化反应1.5-3h，得到固定化失活产朊假丝酵母CICC1769细胞；

（5）将固定化失活产朊假丝酵母(Candida utilis) CICC1769细胞的磁性微球加入柑橘汁中，置于10-20℃下震荡或搅拌处理10～20h，处理结束后进行磁性分离，得去除展青霉素的柑橘汁；

步骤（5）中固定化失活产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC1769细胞的用量与柑橘汁中展青霉素的质量比为1000～5000:1。

2.根据权利要求1所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，步骤（1）的技术参数为：预冷温度-20℃，预冷时间12h，冷冻温度-54℃，真空度5mtorr，干燥时间26h。

3.根据权利要求1所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，步骤（3）中Fe₃O₄磁性纳米粒子与液体石蜡的质量比为1：（150-300）。

4.根据权利要求1所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，步骤（3）中Fe₃O₄磁性纳米粒子与span-80的质量比为1：（2-4）。

5.根据权利要求1所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，步骤（3）中Fe₃O₄磁性纳米粒子与戊二醛的质量比为1：（3-5）。

6.根据权利要求1所述利用磁性微球固定化失活酵母细胞去除柑橘汁中展青霉素的方法，其特征在于，步骤（4）中磁性Fe₃O₄/CTS微球与失活酵母菌粉的质量比为（7-9）：1。