[发明专利]一种维生素B2高产菌株及其制备方法

权利要求书

1.一种维生素B2高产菌株，该菌株名称为Bacillus subtilis 15-1-11，其特征在于：该菌株可抗浓度为10-100mg/L的8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素。

2.一种制备权利要求1所述的维生素B2高产菌株的方法，其特征在于：包括如下步骤：

a)原始菌株的预处理：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)原始菌株(例如枯草芽孢杆菌168)涂布于平板培养基上进行培养，培养得到的平板用蒸馏水进行洗吹，得到枯草芽孢杆菌原始菌株的菌液；

b)将步骤a)得到的菌液在无菌条件下进行紫外诱变，得到紫外诱变菌株；

c)将步骤b)得到的紫外诱变菌株用甲基磺酸乙酯进行化学诱变，得到复合诱变菌株；

d)将步骤c)得到的复合诱变菌株依次接种到代谢底物类似物8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素的基本培养基中进行培养驯化，制得兼具8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素的抗性突变株；

e)将经过上述步骤处理得到的菌株接种到营养培养基中进行培养，得到的营养培养物接种到发酵培养基中进行培养，筛选出生产维生素B2最高的菌株，即为所述的菌株Bacillus subtilis 15-1-11。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤a)中，平板培养基为：酵母粉4.5-5.5g/L，氯化钠9.5-10.5g/L，胰蛋白胨9.5-10.5g/L，琼脂粉17.5-18.5g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为24-36小时。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤b)中，紫外诱变时间为30-60s，诱变高度为40-80cm。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤c)中，甲基磺酸乙酯诱变剂量为0.05-0.5mol/L，诱变时间为20-60分钟。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤d)中，代谢底物类似物的浓度为10-100mg/L，具体驯化操作如下：首先将经过紫外诱变、化学诱变后得到的复合诱变菌株的菌液涂布在含有10-100mg/L 8-氮鸟嘌呤的基本培养基中，在37℃培养5-10天，选出8-氮鸟嘌呤抗性突变株；接着将筛选出的8-氮鸟嘌呤抗性突变株的菌液涂布在含有10-100mg/L8-氮杂腺嘌呤的基本培养基中，在37℃培养5-10天；按照上述方法接菌培养6-氮杂胸腺嘧啶抗性突变株、DL-蛋氨酸亚砜抗性突变株、玫瑰黄素抗性突变株，最终得到兼具8-氮鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、6-氮杂胸腺嘧啶、DL-蛋氨酸亚砜、玫瑰黄素的抗性突变株。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：基本培养基为：葡萄糖4.5-5.5g/L，硫酸铵0.15-0.25g/L，磷酸氢二钾1.5-2g/L，磷酸二氢钾0.5-0.7g/L，柠檬酸钠0.1-0.3g/L，色氨酸0.04-0.06g/L，琼脂粉15-17g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为24-48小时。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤e)中，营养培养基为：葡萄糖9.5-10.5g/L，蛋白胨9.5-10.5g/L，酵母抽取物4.5-5.5g/L，牛肉膏4.5-5.5g/L，氯化镁3.5-4.5g/L，琼脂15-17g/L，pH7.2；培养温度均匀为37℃，培养时间为24-48小时。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤e)中，发酵培养基为：葡萄糖80-90g/L，酵母粉8-15g/L，酵母抽取物4.5-5.5g/L，柠檬酸钠4.5-5.5g/L，七水硫酸镁0.4-0.6g/L，磷酸氢二钾0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，pH7.0；培养温度均匀为37℃，培养时间为48-72小时。