[发明专利]一种评价皮肤刺激性的方法、装置及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及外用药物制剂及化妆品领域，特别是涉及一种评价皮肤刺激性的方法、装置及其应用，可以有效替代目前的动物试验方法。

背景技术

在药物制剂领域，经皮给药由于其方便性，越来越受到重视；在化妆品领域，由于人们对生活质量的要求提高，其市场不断扩大，据估算，我国的外用药物制剂与化妆品的市场规模达到3000亿元/年。根据国家食药监总局颁布的《化妆品安全技术规范》、《药物非临床研究质量管理规范》等相关文件的规定，为了保证安全性，以上产品均需要开展皮肤刺激性评价。

目前常用的皮肤刺激性评价方法主要是借助于动物实验，将动物的部分皮肤暴露，分别涂抹受试产品和对照产品，通过观察皮肤的反应（如是否出现红肿、炎症等）进行评分，或通过处死动物取皮肤做病理切片检查进行评价。这种方法存在以下问题：第一，成本较高，以常用的动物兔子为例，一只兔子100元左右，只能进行一次实验，并且还存在饲养成本；第二，周期较长，动物本身有一个较长的成长周期，而且在目前的皮肤刺激性评价方法下，单次涂抹受试产品后一般需要24~72h观察刺激性试验结果；第三，存在一定的主观性，目前的皮肤反应主要还是通过人为评分进行的，因此不够客观；第四，差异较大，动物的种属、个体、性别、年龄的差异都会影响实验结果，因此重现性往往不佳。此外，动物的使用也存在一定伦理学问题，2013年3月，欧盟国家宣布全面禁止销售和进口经过动物测试的化妆品（含原料）和牙膏、肥皂等日化产品。

因此，如能采用体外装置快速替代动物试验快速评价皮肤刺激性，将有效地解决上述问题，无疑会为外用药物制剂以及化妆品的质量评价提供有力的技术保障。脂质体是一种组成和结构类似于生物膜的微型载体，本研究团队此前已经研制了用于皮肤渗透性试验的脂质体人工皮肤膜技术并申请了专利（申请号：201510818671.3），在此基础上，我们通过结合嵌套装置、优化脂质体制备工艺和载入指示剂进一步研制了一种新型的评价皮肤刺激性的装置（图1、图2、图3）和方法，可以有效替代目前的动物试验方法，用于外用药物制剂和化妆品的皮肤刺激性的快速评价。

发明方案

发明目的：本发明要解决的技术问题是研发一种能够代替活体动物试验的一种简单、快捷、可靠的皮肤刺激性试验方法。该方法采用评价皮肤刺激性的装置，通过接受液指示剂直观显色快速判断皮肤刺激性强弱，从而显著提高皮肤刺激性评价的效率，降低成本，并且显著提高试验的可控性和重现性，最终能够替代动物试验用于外用药物制剂和化妆品的质量控制。

本发明提供一种评价皮肤刺激性的装置，其包含膜嵌套装置和脂质体人工皮肤膜；其中膜嵌套装置由嵌套板、膜嵌套两部分组成，膜嵌套位于嵌套板的孔中，脂质体人工皮肤膜结合在膜嵌套上；

脂质体人工皮肤膜按如下步骤制备：

（1）含有指示剂的脂质体的制备：将磷脂材料溶解于有机溶剂中，指示剂溶解在50~120份含有5~15 %乙醇的磷酸盐缓冲液中，选择薄膜法、注入法或逆相蒸发法制备脂质体，得到的脂质体混悬液采用高压均质或者超声技术减小粒径，分别制得粒径为150~400nm的含指示剂小粒径脂质体和粒径为400~800nm的含指示剂大粒径脂质体。

其中所述磷脂材料包含重量比为1~8 : 1的卵磷脂，胆固醇；指示剂选自罗丹明B、钙黄绿素、羧基荧光素、依文思蓝或异硫氰酸荧光素；

（2）微孔滤膜与膜嵌套底部的密封：将孔径为0.45 μm的微孔滤膜和膜嵌套底部150 ℃加热，使微孔滤膜与嵌套底部形成完全密封的小室；

（3）脂质体与微孔滤膜的结合：将步骤（1）制备所得的1~10份粒径为150~400nm的含指示剂小粒径脂质体和1份粒径为400~800nm的含指示剂大粒径脂质体分别通过离心分层铺于微孔滤膜膜上；

（4）冻融循环；将步骤（3）中结合脂质体后的微孔滤膜置于-70~-120 ℃冷冻0.5~1 h，取出后50~75 ℃加热0.5~1 h，如此循环冻融2~3次，即得脂质体人工皮肤膜。

作为本发明的进一步改进，脂质体人工皮肤膜制备步骤（1）中所述磷脂材料为重量比为1~8 : 1 : 0.2 : 0.6 : 2的卵磷脂，胆固醇，胆固醇硫酸酯、神经酰胺、棕榈酸。

作为本发明的更进一步改进，脂质体人工皮肤膜制备步骤（1）中所述指示剂为罗丹明B。