[发明专利]Sip基因重组载体、壳聚糖‑PLGA包裹Sip基因DNA疫苗及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，更具体地，本发明涉及一种罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体及其制备方法和应用，以及壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是严重的人畜鱼共患传染病之一。近年来，罗非鱼无乳链球菌病在我国南方地区呈大规模爆发，病害发生的范围较广，罗非鱼受感染率与死亡率均较高，个别发病率超过50％，发病鱼死亡率超过95％，造成了严重的经济损失。

目前水产疫苗包括灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗等，核酸疫苗因其制备简单、安全、稳定性好，在免疫功能及生产、保存上有着诸多优点成为未来疫苗的发展方向，能诱导高水平的体液免疫和细胞免疫应答等，尤其是鱼类疫苗。生物可降解PLGA纳米/微米球及其衍生物作为载体用于疫苗免疫、基因治疗已有大量研究报到。壳聚糖、PLGA具有生物可降解性、生物相容性的特点，特别是壳聚糖自身带正电的特性，能够增强与带负电质粒的吸附，并且增强细胞渗透的作用，因而作为口服免疫载体也被认为有潜在优势。壳聚糖、PLGA包裹DNA疫苗有利于增强免疫效果，增强DNA渗透细胞膜，从而增强基因的递呈效率，具有重要的理论和实际意义。

表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)是由Brodeur等经免疫学筛选获得的，研究表明该蛋白可有效保护小鼠、罗非鱼、牛对无乳链球菌的致死感染，具有较强的免疫保护性。Sip蛋白广泛存在于各血清型中，是细菌重要的粘附和定植因子之一，成为无乳链球菌重要的候选疫苗靶标之一。

有研究报道将无乳链球菌sip基因克隆至核酸疫苗质粒pVAX-1载体上构建了核酸疫苗，经减毒沙门氏菌携带口服免疫罗非鱼后，免疫保护率达到57％以上，然而，血清抗体效价仅有1:16；黎炯等将纯化后的重组sip蛋白免疫罗非鱼,免疫组的相对保护率为70％-87％，免疫剂量为3μg/g和5μg/g时受免鱼血清抗体滴度可达1:128000，虽然纯化蛋白免疫罗非鱼免疫保护率和血清抗体滴度较减毒沙门氏菌口服sip疫苗高，但是限于鱼体免疫方式的限制，基于sip蛋白口服疫苗的研制已成为必然趋势。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种罗非鱼无乳链球菌Sip基因重组真核表达载体及其制备方法和应用，以及壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗及其制备方法和应用。

为了实现以上发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体，所述重组载体包括有如SEQ ID No:3所示的碱基序列。

本发明还提供了上述罗非鱼无乳链球菌Sip基因重组真核表达载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)、将Sip基因与pMD^TMl8-T载体连接，转化感受态细胞，得到重组子；

(2)、采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切步骤(1)的重组子，得到包括有如SEQ ID No:3所示碱基序列的基因片段，再采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切质粒pcDNA3.1(+)，连接所述基因片段和酶切后的质粒pcDNA3.1(+)，转化感受态细胞，得到真核表达重组载体-pcDNA-sip。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述Sip基因是以罗非鱼无乳链球菌强毒株基因组DNA为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物进行PCR扩增目的基因。

在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应体系为：5μL 10×Ex Taq PCR buffer、5μL dNTP、1μL模板DNA、1μL引物SEQ ID No:1、1μL SEQ ID No:2、0.25μL Ex Taq DNA polymerase、加dd H₂O至总体积为50μL；所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃终延伸10min。

本发明还提供了上述壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，所述疫苗的活性成分包括上述罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体。

在其中一些实施例中，所述疫苗还包括壳聚糖-PLGA包裹微球，所述罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体体积为600μL,浓度0.5～1.5mg/mL。