[发明专利]一种酶及其编码基因和它们的应用以及制备人参皂苷化合物K的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种酶及其编码基因和它们的应用以及一种制备人参皂苷化合物K的方法。

背景技术

人参皂苷化合物K(人参皂苷Compound K，人参皂苷CK，结构式如下式I所示)是二醇型人参皂苷(例如，人参皂苷Rb₃和绞股蓝皂苷IX，结构式分别如下式II和III所示)在人体肠道内的主要代谢产物，属于稀有人参皂苷。研究发现人参皂苷CK在体内外都有良好的抑制肿瘤细胞生长和转移的作用，是一种潜在抗肿瘤药物，并且在抗衰老、改善记忆、抗炎等各方面都有一定的疗效。因此，如何获得大量的人参皂苷CK是目前药学研究的重点。

目前，人参皂苷CK主要通过生物转化法或生物合成法获得。其中，生物转化法是利用有机体(细胞、细胞器)或酶作为催化剂实现化学转化的过程，是生物体系(包括细菌、真菌和植物组织等)对外源性底物进行结构修饰的化学反应。其本质是利用生物本身所产生的酶对外源底物进行的催化反应。生物转化具有反应条件温和、不易破坏皂苷结构、副产物少、后处理简单及对环境友好等优点。近年来，以人参皂苷为原料进行生物转化以获得人参皂苷CK的研究越来越多，特别是利用微生物或酶对二醇型人参皂苷的C3和C20位的糖苷结构进行修饰，使含量较高的人参皂苷的糖苷经过水解作用，定向转化为人参皂苷CK。根据构成糖苷结构的糖基的不同，人参皂苷中常见的糖苷结构包括葡萄糖苷、木糖苷、乳糖苷、阿拉伯糖苷等。但是，现有的用于人参皂苷生物转化的酶大部分具有高度专一性，即仅可以特异性作用于某一种糖苷结构，而无法满足同时作用于一种以上糖苷结构的要求，从而导致转化率较低。因此，急需研发可以同时作用于一种以上糖苷结构的酶，以提高生成人参皂苷CK的生物转化率。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种新型的具有木糖苷酶和/或葡萄糖苷酶双功能的酶及其编码基因和它们的应用以及制备人参皂苷化合物K的方法。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种酶，其中，该酶为(a)或(b)：

(a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的酶；

(b)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活性不变的由(a)衍生的酶，或者，由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶。

第二方面，本发明提供了编码第一方面所述酶的基因。

第三方面，本发明提供了含有第二方面所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

第四方面，本发明提供了一种组合物，其中，该组合物含有第一方面所述的酶作为活性成分。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的酶、第二方面所述的基因、第三方面所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，以及第四方面所述的组合物中的任意一项在降解糖苷类化合物中的应用。

第六方面，本发明提供了一种制备人参皂苷化合物K的方法，该方法包括：在酶解条件下，将含有糖苷类化合物的原料与酶接触，其中，所述酶由第一方面所述的酶和/或由第四方面所述的组合物提供。

通过上述技术方案，将本发明提供的酶用于降解人参皂苷Rb₃、绞股蓝皂苷IX和三七叶总皂苷时，其可能能够作用于人参皂苷Rb₃和绞股蓝皂苷IX中C20位的木糖糖苷结构，同时也可将其C3位的两个葡萄糖水解下来，从而获得人参皂苷CK，并且人参皂苷CK的转化率在84％以上。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明的实施例1获得的重组质粒的双酶切验证结果，其中，1为DNA标记物，2-5为重组质粒；

图2为本发明的实施例1获得的重组酶SDS-PAGE电泳图，其中，M为蛋白标记物，1为粗酶液，2为纯化的酶液；

图3为本发明的实施例1中酶活力测定的标准曲线图；