[发明专利]蛋白质脱酰胺化的检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及蛋白质脱酰胺化的检测方法及其应用，更具体地，本发明涉及蛋白质前处理方法、蛋白质脱酰胺化的检测方法以及确定蛋白药物生产工艺的方法。

背景技术

蛋白质脱酰胺化是蛋白质储存过程中一种常见的降解反应。生物体内脱酰胺化是一种重要的蛋白质翻译后修饰(posttranslational modification)，主要在脱酰胺酶的催化作用下完成；脱酰胺化常作为许多生物学过程的分子钟(molecular clock)影响蛋白质的合成和代谢的周期调控、细胞增殖及蛋白折叠等过程。许多蛋白质在生产和储存过程中会发生非酶催化的脱酰胺化，是导致蛋白质活性损失的主要原因之一，常导致蛋白质的局部亲/疏水性发生变化，并在很大程度上影响蛋白质的空间结构、降低生物活性甚至改变其生物学功能；此外，脱酰胺化还可能影响蛋白质的代谢动力学。

因此，为控制产品质量，研究药用蛋白质在不同条件下的脱酰胺程度对于筛选合适存储条件、优化制剂配方、分析蛋白结构、减少活性损失具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够特异、灵敏、快速、准确地测定蛋白质脱酰胺化程度的方法。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种蛋白质前处理方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将所述蛋白质进行第一稀释处理，所述第一稀释处理是在蒸馏水中进行的，第一稀释处理后的蛋白质的浓度为1mg/ml～4mg/ml；(2)将所述第一稀释处理后的蛋白质进行氮吹干处理，任选地，所述氮吹干处理是在氮气的流量为10～15L/min的条件下进行的；(3)将氮吹干处理后的蛋白质进行变性处理，所述变性处理是将所述氮吹干处理后的蛋白质与尿素进行接触实现的；(4)将变性处理后的蛋白质进行二硫键破坏处理，所述二硫键破坏处理是通过将所述变性处理后的蛋白质与DTT进行接触实现的；以及(5)将经过二硫键破坏处理后的蛋白质进行消化处理，以便获得变性酶解后的蛋白质，其中，所述消化处理是通过将所述经过二硫键破坏处理后的蛋白质与胰酶在37℃的条件下进行1～2h的接触实现的，所述胰酶与所述经过二硫键破坏处理后的蛋白质的质量比为1:20～1:100。发明人经过实验发现，本发明所提出的蛋白质前处理方法能够充分消除蛋白二级结构的影响，充分暴露蛋白质中氨基酸的结构，从而便于后续对变性酶解后蛋白样品的检测，并且本发明所提出的方法不会引起蛋白质原氨基酸的结构变化，进而能够有效避免对后续检测的干扰。

根据本发明的实施例，上述蛋白质前处理方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，基于50微升稀释处理后的蛋白质，浓度为8M的所述尿素的用量为20微升，浓度为5mM的所述DTT的用量为2.2微升。发明人发现，在上述处理条件下，二硫键被充分打开、蛋白质变性彻底。

根据本发明的实施例，上述蛋白质前处理方法进一步包括：进行所述消化处理前，预先将所述经过二硫键破坏处理后的蛋白质进行第二稀释处理，所述第二稀释处理在Tris-HCl中进行的。发明人发现，第二稀释处理能够显著降低尿素以及DTT对胰酶活性的干扰，也能够显著降低尿素以及DTT对消化处理的干扰，进而最大限度地保证胰酶对蛋白质的充分消化。

根据本发明的实施例，基于50微升稀释处理后的蛋白质，浓度为50mM的所述Tris-HCl的用量为60微升。发明人经过实验发现，在上述第二稀释倍数下，稀释所带来的降干扰效果更加显著。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种蛋白质脱酰胺化的检测方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)按照前面所述的方法，对待测蛋白质进行前处理，以便获得变性酶解后的蛋白质；(2)将所述变性酶解后的蛋白质进行PIMT酶催化处理，PIMT酶催化处理反应体系为