[发明专利]一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法

权利要求书

1.一种测定血液中抗体氨基酸序列的方法，其包括的步骤为：

A、将与特定抗原结合的特异性抗体从血液或血液制品中分离；

B、将步骤A中分离的特异性抗体采用蛋白酶酶切产生抗体片段，所述抗体片段包括F(ab’)₂、Fab或Fc；

C、将步骤B中得到的抗体片段采用一维聚丙烯酰胺电泳与离子交换色谱、正向色谱、反向色谱、二维聚丙烯酰胺电泳或等电聚焦电泳分离，得到不超过五个不同氨基酸序列抗体片段的组分；

D、将步骤C中分离的每个抗体片段组分进一步切割成5-60个氨基酸的肽段，所述切割方法为采用蛋白酶切割法或化学反应切割法，其中所述蛋白酶切割法采用至少三种蛋白酶；

E、测定步骤D中所得到肽段的氨基酸序列；

F、将步骤E中测定的肽段氨基酸序列通过重叠部分拼接成抗体序列。

2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤A中采用亲和层析法将与特定抗原结合的特异性抗体从血液中分离。

3.根据权利要求2所述的方法，亲和层析法中抗原作为亲和层析的配体。

4.根据权利要求2所述的方法，亲和层析法中抗原结构类似物作为亲和层析的配体。

5.根据权利要求1所述的方法，所述步骤B中采用蛋白酶选自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或者IDES(SEQ ID NO:7)。

6.根据权利要求5所述的方法，所述步骤B中采用的蛋白酶是IDES(SEQ ID NO:7)。

7.根据权利要求1所述的方法，所述步骤C中采用离子交换色谱、反相色谱、一维聚丙烯酰胺电泳和二维聚丙烯酰胺电泳逐步将步骤B中的抗体片段分离成含有至多两个氨基酸序列的抗体片段组分。

8.根据权利要求1所述的方法，所述步骤D中蛋白酶选自：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、赖氨酸蛋白酶、精氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、链霉素蛋白酶E、弹性蛋白酶。

9.根据权利要求1所述的方法，所述步骤D中选择四到六种不同的蛋白酶酶切步骤C中分离的抗体片段组分。

10.根据权利要求9所述的方法，所述步骤D中选择的蛋白酶包括胰蛋白酶(trypsin)。

11.根据权利要求1所述的方法，所述步骤C中每个抗体片段组分进一步切割成5到40个氨基酸的肽段，所述步骤E中采用质谱分析方法测定抗体肽段的氨基酸序列。

12.根据权利要求1所述的方法，所述步骤C中每个抗体片段组分进一步切割成20到60个氨基酸的肽段，所述步骤E中采用Edman降解法测定抗体肽段的氨基酸序列。

13.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述步骤A前采用A蛋白亲和层析柱分离血液或血液组分中IgG抗体。

14.根据权利要求1所述的方法，所述方法中所述步骤B前还包括采用肽N-糖苷酶F酶去除抗体分子上的N-糖基。

15.根据1至14任一权利要求所述的方法，所述血液取自脊椎动物。

16.根据权利要求15所述的方法，所述脊椎动物选自：人、小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛、骆驼、猴子或猩猩。