[发明专利]荧光探针的制备方法及基于荧光探针的土霉素检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及化学分析检测技术领域，具体涉及一种荧光探针的制备方法及基于荧光探针的土霉素检测方法。

背景技术

抗生素是一类特殊药品,可用于人类疾病的感染治疗，或作为兽药以防止牲畜的细菌感染和增加它们的增长率。土霉素(Oxytetlacycline,OTC)，别名地霉素，地灵霉素，氧四环素，四环素等，属于四环素类抗生素，广泛用于动物感染性疾病的治疗。在动物饲料中，其经常作为兽药抗生素和生产促进剂而广泛使用，已经导致它在食品，如肉，奶和蛋制品积累，并已经对人体健康造成了严重威胁。我国是抗生素的生产和使用大国，仅2003年我国仅土霉素产量就达到了一万吨，占世界土霉素生产总量的65％。随着环境中微量污染物问题被不断提出，对这些抗生素的检测就越来越重要，而抗生素的检测方法成为相关研究的重要因素。

用于探测土霉素的传统方法主要有以下几种：酶联免疫吸附法，色谱法和毛细管电泳法，包括色谱质谱连用法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等。然而这些方法，要么是步骤繁琐，且所用的试剂多是一些环境不友好型试剂；要么需要使用到复杂而昂贵的仪器和较长的检测时间，实用性差。因此，发展一种高效快速的土霉素检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于客服现有技术的不足，提供一种合成简单、成本较低、反应条件温和的荧光探针的制备方法，并利用该探针对食品、环境、生物样品等中的土霉素进行荧光检测。该检测方法具有灵敏度高、选择性好，抗干扰能力强等诸多优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取吡咯和戊二酸酐溶于适量二氯甲烷中，得到混合物，然后迅速将混合物加入到三口烧瓶中，在N₂保护下，用滴液漏斗向三口烧瓶中逐滴加入三氟化硼乙醚络合物，于常温下充分搅拌，反应8-9小时；

所述吡咯、戊二酸酐、三氟化硼乙醚络合物的摩尔比为2：1：6-8；

(2)在冰浴的环境下，用滴液漏斗向三口烧瓶中缓缓加入三乙胺，搅拌3.5-4小时后停止反应；

所加入的三乙胺与三氟化硼乙醚络合物的摩尔比为1：1-1.25；

(3)将上述步骤得到的反应液用石油醚和二氯甲烷的混合溶液萃取3次，收集下层极性较大的二氯甲烷层(黄绿色溶液)，所述石油醚和二氯甲烷的体积比为2-2.5:1；

(4)将萃取得到黄绿色溶液旋转蒸发浓缩至干，收集固体，所述固体用二氯甲烷溶解后，用硅胶柱层析分离，收集中间一段亮绿色溶液并旋转蒸发浓缩，收集固体并干燥后，得到红棕色固体，即荧光探针。

所述硅胶柱层析分离采用的淋洗剂为甲醇和二氯甲烷的混合液，所述甲醇和二氯甲烷的体积比为1:3-4。

本发明的另一目的在于提供一种基于本发明所述荧光探针的土霉素检测方法，包括以下步骤：

(1)绘制标准工作曲线：制备系列不同浓度的土霉素标准溶液，取若干支试管，分为空白荧光对照组和实验组，所有试管中加入磷酸盐缓冲溶液和荧光探针，然后向实验组的试管中加入不同浓度的土霉素标准溶液，空白荧光对照组不加土霉素标准溶液，测定所有试管中溶液的荧光强度；

空白荧光对照组的荧光强度为F₀，实验组的荧光强度为F，计算减弱的荧光强度△FI＝F₀-F，以不同的土霉素的浓度C₀与对应减弱的荧光强度△FI作图，绘制标准工作曲线；

(2)测定样品中土霉素浓度：按照步骤(1)的方法，向试管中加入磷酸盐缓冲溶液和荧光探针，然后向试管中加入待检测样品，测定试管中加入样品前后溶液的荧光强度并计算变化值，将检测结果与标准工作曲线对比，推算出待检测样品中土霉素含量。

所述荧光探针与磷酸盐缓冲溶组成的混合物中，荧光探针的摩尔浓度为1.0×10^-5mol/L。

所述荧光探针与磷酸盐缓冲溶组成的混合物中，磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度为10-15mmol/L，pH＝7.0。

所述荧光强度测定参数为：激发光狭缝为1.5nm，发射光狭缝为1.5nm，激发光波长为358nm。

进一步，为确保荧光检测的准确性，加入土霉素标准溶液或待检测样品8-10min后再测定荧光强度。

本发明采用以上技术方案，使用荧光法检测土霉素，以氟硼荧光染料(BODIPY)为荧光团，其结构如下：

所采用的荧光探针的合成路线如下：