[发明专利]一种检测癌细胞内溶酶体pH的荧光探针

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于癌细胞内溶酶体pH成像的新型比率型荧光探针及其应用，属于分析化学技术领域。

背景技术

细胞内pH值作为新陈代谢的一个重要的参数，在细胞周期调控、细胞的z增值与凋亡、离子转运、酶活性、钙调控、肌肉收缩等细胞生理调控和病理过程中发挥着非常重要的作用。同时，细胞的内吞作用以及受体配体的内化作用也同样受细胞内pH的影响。细胞内pH异常会导致生物体内细胞和组织器官的生理功能紊乱、酶和蛋白质活性受到抑制、人体的免疫力下降，最终引发炎症、癌症以及阿尔茨海默症等疾病。研究表明，在细胞凋亡初期，癌细胞通常会产生起细胞内的酸化作用，因此细胞内酸化已成为细胞凋亡的一个重要的早期特征。此外，细胞内 pH变化同时与细胞凋亡密切相关。因此，对细胞内 pH进行准确地进行原位实时监测，有助于从细胞水平上研究细胞的生理和病理过程。

溶酶体(lysosomes)是真核细胞中的一种细胞器，通常具有单层膜包被的囊状结构，多为球形，大小约0.025~0.8微米。溶酶体内含蛋白酶、核酸酶、脂肪酶及硫酸脂酶等许多酶，为细胞内的消化器官，可分解各种蛋白质等大分子物质，具有溶解或消化的功能。溶酶体内的降解酶在弱酸性条件下（pH约为5）发挥最佳活性，但是当溶酶体内的pH异常时，由于各种降解酶的活性发生变化，其溶解消化功能会受到不同程度的影响，进而导致类风湿关节炎、肿瘤等疾病的发生。因此，迅速准确地检测细胞内溶酶体的pH值可为研究相关生理和病理过程，以及预防关节炎、癌症等相关疾病提供重要的信息。

荧光成像分析法具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、操作简单等优点，而且对细胞基本没有损伤，已经广泛用于各种生物小分子的检测。目前，用于检测细胞内pH值的荧光探针也得到了迅速发展，其中一些已经商品化。但是，目前报道的和已经商品化的溶酶体pH荧光探针大都不具备溶酶体靶向，一般对所有细胞都有相应。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、光稳定性及透膜性好，且具有癌细胞靶向的溶酶体pH荧光探针具有重要的意义。

发明内容

针对以上技术问题，本发明提供了一种新型检测癌细胞内溶酶体pH的新型荧光探针及其应用。

本发明所述的新型检测癌细胞内溶酶体pH的荧光探针为含有生物素基团的萘酰亚胺衍生物，其特征在于：所述荧光探针的化学结构通式如式（I）所示，其中生物素部分具有癌细胞靶向性：

式（I）

本发明所述检测生物体系内次氯酸的荧光探针的制备方法为：将式（Ⅱ）所示的化合物a1 (1 mmol)、a2 (1 mmol)、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（2 mmol）、1-羟基苯并三氮唑（1.5 mmol）、三乙胺（2.2 mmol）和N,N-二甲基甲酰胺 (5 mL)加入到50 mL单口烧瓶中，室温搅拌16小时，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析纯化，得到浅黄色产物即为本发明所述检测癌细胞内溶酶体pH的比率型荧光探针。

式（Ⅱ）

本发明所述的荧光探针在检测癌细胞内溶酶体pH的应用。

本发明所述的荧光探针可应用于癌细胞内溶酶体pH的检测评价。该探针作为癌细胞溶酶体pH的特异性探针，可在不同pH环境下，通过萘酰亚胺部分吗啉基团的质子化，生成具有不同荧光发射能力的形态，通过检测不同形态的荧光强度来测定癌细胞溶酶体中的pH。

具体测定方法为：室温条件下，配制5 μM荧光探针乙醇溶液，加入到具有不同pH值的B-F缓冲液体系中，测定溶液荧光强度作为pH的评价指标。

本发明所述的荧光探针在酸性条件下，萘酰亚胺荧光团的吗啉部分将会发生质子化，从吗啉到萘酰亚胺荧光团的PET作用将被抑制，此时荧光探针可以发射萘酰亚胺荧光团的绿色荧光（峰值约为531 nm）；在碱性条件下，萘酰亚胺荧光探针的荧光因来自于吗啉的PET作用而得到淬灭，此时萘酰亚胺荧光团的绿色荧光（峰值约为531 nm）将减弱。同时，由于生物素具有癌细胞靶向性，吗啉具有溶酶体靶向功能，因此该荧光探针可以用于检测癌细胞溶酶体内的pH。可采用荧光检测器实现产物的快速灵敏检测；检测条件为：激发波长为380 nm，在420~700 nm之间进行荧光发射光谱的检测。