[发明专利]一种抗体标记的碳纳米颗粒的制备方法及使用其制备的早孕试纸条

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于早孕检测的抗体标记的碳纳米颗粒的制备方法及其试纸条的制备，属于医学检验领域。

背景技术

早孕(早期妊娠)指怀孕的时间在怀孕13周末之前。约有半数妇女在停经6周左右出现畏寒、头晕、流涎、乏力、嗜睡、食欲缺乏，厌恶油腻、恶心、晨起呕吐等症状，称为早孕反应，这种早孕反应在12周左右自行消失。而对于怀孕在6～8周前的女性没有明显的早孕反应，此时就需要一种快捷方便、经济简单的方法来判断是否怀孕。对希望优生的妇女来说，早孕检测可注意避免接触有害物质或滥用药物；对暂时不想怀孕的妇女来说，可及时采取适当方式终止妊娠。因此，早孕检测是十分必要的，是对自身健康负责的表现。

早孕试纸是人们设计出来的一种方便女性检测自己是否怀孕的产品。从妊娠的第7天开始，孕妇的尿液中就能测出一种特异性的激素--人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，简称HCG)，早孕试纸的工作原理是检测HCG值。免疫层析发法因其操作简便，效率高、用量少、成本低廉，今年来在早孕检测领域得到了快速发展。目前市场上大多数的早孕试纸是采用胶体金方法检测的，但胶体金的生产成本相对较高，且当金颗粒过大时，标记物又不稳定，长期贮存容易发生自动聚集，信号较弱等限制了其应用。因此需要一种稳定的，灵敏度高，易制备，价格低廉的纳米颗粒替代胶体金用于早孕检测的免疫层析。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供了一种抗体标记的碳纳米颗粒并快速检测早孕的免疫层析方法及其试纸的制备，实现早孕的快速检测并解决胶体金成本高，信号较弱，测试线显色不明显等问题。本发明的抗体标记的碳纳米颗粒早孕试纸的制备方法包括以下步骤：

与现有技术相比，本发明提供了一种可替代胶体金的纳米颗粒，纳米碳球(carbon spheres)。此碳纳米颗粒是一种无定形碳，易制备，价格低廉，用于免疫侧向层析检测比胶体金更稳定、更敏感、灵敏度更高。制备方法成熟、简单：以价格低廉的葡萄糖为原料，以水热合成法制备分散性较好的碳纳米颗粒,调节相应的反应温度和时间，可调节其粒径在200nm左右。具体步骤包括：

(1)将葡萄糖溶解在去离子水中(葡萄糖溶液的浓度为6％)，搅拌至其完全溶解。将溶液加入到水热反应釜中，密封后置于180℃烘箱内反应4h。

(2)反应结束后，降至室温，取出反应釜，将釜内褐色溶液抽滤(用40μm有机滤膜)，用95％乙醇清洗多次至滤液为无色，最终用去离子水清洗。

(3)将产物置于70℃干燥烘箱中干燥12h，得到的产物以5～10mg/mL的浓度分散在去离子水中，以分散液在室温下储存在阴凉干燥处。

本发明还涉及了一种抗体标记的碳纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将碳纳米颗粒加到浓硫酸：浓硝酸：蒸馏水的比例为3:1:6的混合液中形成分散液，在室温下缓慢搅拌作用2h。

(2)反应结束后，分散液在13000rpm下离心5min，移除上清液，用去离子水多次清洗，直到分散液的pH值达到7.0，最终重悬至10mg/mL。

(3)取步骤(2)中的碳纳米颗粒分散液置于离心管中，超声处理1.5min，随后加入缓冲溶液低速震荡10s。

(4)向步骤(3)中的碳纳米颗粒缓冲溶液中迅速滴入活化剂，快速置于涡旋振荡器上低速震荡1min后，固定在涡旋振荡器上，室温下震荡活化30min。

(5)活化结束后，将步骤(4)中的碳纳米颗粒分散液在26℃，14000rpm下，离心12min后移去上清液，用缓冲溶液清洗，再次以相同条件离心后，弃去上清液，用缓冲溶液复溶重悬。

(6)取β-HCG单克隆抗体，加入缓冲溶液稀释至0.06mg/mL。

(7)将步骤(5)中复溶的纳米颗粒分散液加入到步骤(6)中的抗体稀释液中，立刻在涡旋震荡器上震荡1.5min，随后超声1.5min，然后固定在涡旋振荡器上在室温下震荡反应1h。

(8)反应结束后，将步骤(7)中溶液超声1min，在26℃，14000rpm下，离心12min后移去上清液，加入封闭液，同样然后固定在涡旋振荡器上在室温下震荡反应1h。

(9)将步骤(8)中溶液离心后再次加入封闭液清洗，在26℃，14000rpm下，离心12min后移去上清液，可得到抗体标记的碳纳米颗粒。

步骤(1)中碳纳米颗粒的酸混合液浓度为1mg/mL。

步骤(3)以及步骤(5)中的清洗的缓冲溶液是2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶液，其pH为5.6。