[发明专利]模板‑引物核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒

权利要求书

1.一种模板-引物核酸分子，其特征在于，所述模板-引物核酸分子包括模板链和引物链；所述模板链包括3'端的模板配对区和5'端的单链区；所述引物链与所述模板配对区互补配对形成双链配对区；所述单链区为由多个重复单元组成的单链核苷酸序列，所述重复单元是长度为1-10bp的单链核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的模板-引物核酸分子，其特征在于，所述单链区长度为15-150bp。

3.根据权利要求1所述的模板-引物核酸分子，其特征在于，所述重复单元为d（A）、d（T）、d（C）、d（G）、A、G、C或U。

4.一种聚合酶活性测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、制备聚合酶延伸反应体系并进行聚合酶延伸反应，所述反应体系包括模板-引物核酸分子、待测聚合酶、底物和适宜所述待测聚合酶发挥活性的缓冲液；

B、终止聚合酶延伸反应，并通过荧光检测装置检测所述反应体系中反应产物结合双链DNA染料产生的第一荧光强度，以所述第一荧光强度表征所述待测聚合酶活性；所述双链DNA染料在反应体系制备时加入，或在所述聚合酶延伸反应过程中的任意时刻加入，或在所述聚合酶延伸反应终止时或终止后加入；

所述模板-引物核酸分子为权利要求1-3中任一项所述的模板-引物核酸分子；所述底物为dNTP和/或NTP。

5.根据权利要求4所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述待测聚合酶为热启动聚合酶，所述聚合酶延伸反应开始前还包括热启动步骤。

6.根据权利要求4所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述双链DNA染料为Eva Green、Sybr Green I、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，还包括以下步骤：

C、根据第二荧光强度与参照品的量的标准曲线，将所述第一荧光强度换算成对应的参照品的量，以所述参照品的量表征所述待测聚合酶活性；所述参照品为由两条单链核苷酸序列完全互补配对形成的双链核酸分子，或具有茎环结构且3'端和5'端完全互补配对的单链核酸分子；所述第二荧光强度为所述参照品结合双链DNA染料产生的荧光强度。

8.根据权利要求7所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，还包括以下步骤：

D、将所述参照品的量换算为底物消耗量，以所述底物消耗量来表征所述待测聚合酶活性。

9.一种聚合酶活性测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、制备一系列包括不同待测聚合酶酶量的聚合酶延伸反应体系并进行聚合酶延伸反应，所述反应体系还包括模板-引物核酸分子、底物和适宜所述待测聚合酶发挥活性的缓冲液；

B、终止聚合酶延伸反应，并通过荧光检测装置检测所述各反应体系中反应产物结合双链DNA染料产生的第一荧光强度；拟合所述第一荧光强度与所述待测聚合酶酶量之间的关系曲线，以待测聚合酶酶量在关系曲线中对应的第一荧光强度表征所述待测聚合酶活性；所述双链DNA染料在反应体系制备时加入，或在所述聚合酶延伸反应过程中的任意时刻加入，或在所述聚合酶延伸反应终止时或终止后加入；

所述模板-引物核酸分子为权利要求1-3中任一项所述的模板-引物核酸分子；所述底物为dNTP和/或NTP。

10.根据权利要求9所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，所述双链DNA染料为Eva Green、Sybr Green I、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。

11.根据权利要求9或10所述的聚合酶活性测定方法，其特征在于，还包括以下步骤：

C、根据第二荧光强度与参照品的标准曲线，将所述第一荧光强度换算成对应的参照品的量；拟合所述参照品的量与所述待测聚合酶酶量之间的关系曲线，以待测聚合酶酶量在关系曲线中对应的参照品的量表征所述待测聚合酶活性；所述参照品为由两条单链核苷酸序列完全互补配对形成的双链核酸分子，或具有茎环结构且3'端和5'端完全互补配对的单链核酸分子；所述第二荧光强度为所述参照品结合双链DNA染料产生的荧光强度。