[发明专利]降低种子重量的白桦AP2基因及其编码蛋白

说明书

技术领域：本发明涉及一个降低种子中游离脂肪酸及可溶性蛋白合成的白桦AP2基因及其编码蛋白，属于分子生物学中的基因技术领域。

背景技术：

通过对拟南芥的研究发现，在花发育相关基因中大多数基因均属于MADs-box家族的基因，唯独AP2基因具有独特的AP2结构域，该结构域是一个DNA结合结构域，由60到70个左右保守的氨基酸残基组成的3个反向平行的β-折叠和一个两亲性的α-螺旋构成。AP2/EREBP转录因子家族根据其所含AP2结构域数量的不同可分为三类：含有2个AP2结构域的AP2亚家族、含有一个AP2结构域的EREBP亚家族以及含有一个AP2结构域和一个B3结构域的RAV1和RAV2。1994年Jofuku等在拟南芥中发现了AP2(APETALA2)转录因子，同时首次鉴定出了AP2基因的AP2/EREBP结构域。1995年Ohme-Talagi等成功从烟草中分离出4个乙烯反应结合蛋白EREBPs。相关报道表明AP2亚家族在生殖器官和营养器官的发育中具有关键的调节作用。在拟南芥的花器官发育过程中，A类功能基因AP2可以抑制C类功能基因AG(AGAMOUS)在外轮花器官萼片和花瓣中的表达，对萼片和花瓣的发育起着重要的作用，AP2基因不仅在花器官中有表达，在茎、叶和种子等非花组织中也有表达。金鱼草中的LIP1和LIP2均属于AP2转录因子家族，作为A类基因的它们在金鱼草萼片、花瓣和胚珠的发育过程中都具有决定性的作用。但与AP2基因不同的是，LIP基因并不抑制C类基因的表达。AP2基因在种子的发育过程中也起着重要作用，它可以决定种子的大小、重量以及油类物质和蛋白质的积累。苹果的MAP2A基因在花芽、萼片、花瓣、雌雄蕊、子房等花器官以及非花器官叶片中均有表达，说明MAP2A可以调控花器官和营养器官的发育。葡萄的Vv-AP2基因对葡萄的营养器官和生殖器官的发育具有不同的作用。植物的分生组织既有不断的分化出新的组织器官的能力，又要维持自身的分生能力。AP2基因可以维持植物分生组织的分生能力。水稻SNB(SUPERNUMERARY BRACT)是AP2亚族转录因子，它可以调控穗分生组织向花分生组织转变以及花器官发育。玉米IDS1(INDETERMINATE SPIKELET1)是拟南芥AP2基因的同源基因，可以通过调控小穗分生组织特性来调控花序的发育。目前，对于白桦的AP2基因的功能尚不清楚，也没有涉及白桦AP2基因序列及其功能的相关专利报道。

发明内容：

本发明提供一种从白桦中克隆白桦花发育相关基因AP2的方法：

(1)先采用改良的CTAB法提取白桦雌花RNA，用ThermoScriptTM RT-PCR System反转录试剂盒，合成cDNA第一链；

(2)设计含有酶切位点(XbaI和SmaI)克隆白桦AP2编码区全长的PCR引物；引物序列为：正向引物：AP2-F：5′-GCGCTTCTAGAATGTGGGATCTCAATGACTCG-3′；反向引物：AP2-R：5′-GTATCCCGGGATAGAGGGTCTCATGAGAGAAT-3′

(3)利用引物AP2-F和AP2-R对合成的cDNA进行PCR扩增，获得一个AP2转录因子基因的全长cDNA，命名为白桦AP2；

PCR扩增产物经测序，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；

本发明构建了白桦AP2基因的植物表达载体，构建的植物表达载体(pBI121-AP2)经农杆菌浸染拟南芥植株，获得转基因拟南芥植株且转基因纯系植株所结种子中游离脂肪酸含量及可溶性蛋白含量均有所下降，表明该基因具有降低拟南芥种子游离脂肪酸及可溶性蛋白含量的功能并且能够调控两种物质的生物合成途径。

构建白桦AP2基因植物表达载体的技术方案如下：

选择pBI121载体作为基本植物表达载体，在pBI121上选择XbaI和SmaI两个酶切位点，设计带有酶切位点和保护碱基的白桦AP2引物，并克隆出白桦AP2基因全长。双酶切质粒和白桦AP2基因，再用T4连接酶进行连接，检测构建的载体pBI121-AP2。