[发明专利]一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片、试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白检测技术，特别涉及一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片、试剂盒及其制备方法。

背景技术

脱-r-羧基凝血酶原(Des--carboxy-prothrombin,DCP)是肝细胞癌产生的异常凝血酶原，与正常凝血酶原相比，DCP的分子结构特点是其丙氨酸结构域(Gla domain)中的一个或者多个谷氨酸(Glu)残基没有被完全羧化成为Gla,从而失去凝血功能。正常的凝血酶原是在肝细胞微粒体内，主要依赖维生素K的γ谷氨酰羧化酶及辅酶和Vitamin K reductase参与下，将结构Gla Domain中的第6,7,14,16,19,20,25,26,29和32位的10个Glu残基羧化为Gla,成为有活性的凝血酶原，上述任何一点或多个Glu残基羧化不全，都将可能形成DCP,失去凝血功能。原发性肝癌血清中的DCP明显升高。

目前检测DCP一般用常规的ELISA方法，据陆枫林等人发表的《去γ-羧基凝血酶原对原发性肝细胞癌的诊断价值》，中国肿瘤临床2009年07期的记载，采用ELISA方法，对门诊诊断为原发性肝癌的患者血清进行检测，结果显示灵敏度和特异性分别为78.95％和85.42％，须采血3-5ml，而且该方法所需抗体、血清量都较高，这一方面导致成本高，另一方面，由于灵敏度不够，导致假阴性比例较大。

在门诊中准确检测血清中是否存在DCP以及其水平，对于临床诊断肝癌具有重要意义。低成本、快速高效、准确、高通量检测手段是最好的选择，但是目前没有关于高通量检测DCP的报道，普通的Elisa方法虽然达到灵敏度和特异性分别为78.95％和85.42％，须采血3-5ml，而高通量检测中采用这么大的血清量则对应地需要大量捕获抗体，检测斑的尺寸势必非常大，无法做成集成的高通量芯片，成本非常高，在门诊中普及并不现实。DCP在血清中含量非常低，如果降低血清用量和抗体量，做成高通量芯片，则很难提高检测灵敏性和特异性，发明人推测这是目前没有检测DCP的蛋白芯片的原因。

发明内容

本发明基于蛋白芯片领域在血清中DCP的检测技术的需求及空白，提供了一种适合于检测生物样品中DCP的蛋白芯片、试剂盒及其制备方法。专门针对血清中的DCP具有省时、经济、准确、便捷的优点。

本发明的技术方案如下：

一种检测异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片，其特征在于：

所述蛋白芯片的基质载片上至少包括一个检测亚区，一个所述检测亚区检测一份血清样品；

所检测亚区内设置有检测斑区域和对照斑区域，所述检测斑区域有固定DCP特异性抗体形成检测斑，所述对照斑区域有固定牛血清白蛋白形成对照斑；

同一个检测斑区域内的所有检测斑上的物质的浓度相同；

每一个所述检测斑固定的DCP特异性抗体的总量为3nl,是进行6-10次喷涂，每次喷点300-500pl而成。

喷点温度为4-8℃。

所述DCP的特异性抗体为鼠抗人DCP。

所述基质载片上具有多个所述检测亚区，所述每个检测斑区域包括排列成1排的4个检测斑，所述对照斑区域包括排列成1排的4个对照斑；所述检测斑和对照斑排成平行的两列。

所述检测亚区之间设置有凸起作为物理隔断。

上述用于检测异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片的制备方法，其特征在于：每一个所述检测斑上固定的DCP特异性抗体进行6-10次喷点，每次喷点300-500pl，喷点总量为3nl。

所述检测斑在4-8℃摄氏度下喷点而成。

一种检测异常脱羧凝血酶原的试剂盒，其特征在于：包括上述蛋白芯片。

还包括，HRP标记的凝血酶原多克隆抗体，HRP化学发光底物液；所述HRP标记的凝血酶原多克隆抗体为兔源抗体，与所述检测斑上固定的DCP特异性抗体来源于不同物种。

还包括用于洗涤和稀释的常规试剂PBST和PBS。

一种检测凝血酶原和DCP的方法，其特征在于：采用上述任一化学发光蛋白芯片，包括如下步骤：

将待测血清样本稀释后滴加在所述化学发光蛋白芯片的检测亚区上，孵育后，用PBST洗涤检测亚区，去除非特异结合物；

加入用PBS稀释的HRP标记的凝血酶原抗体,孵育后，用PBST洗涤，去除非特异结合物；

加入HRP底物发光液，用化学发光扫描仪对蛋白芯片进行扫描，分别得到稀释后待测血清样本中的DCP发光像素值；

所述孵育指37℃孵育30分钟。