[发明专利]一种高精氨酸混合肽的制备方法及其在肝癌治疗中的应用

权利要求书

1.一种高精氨酸混合肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)：将经脱脂粉碎的核桃粕、鸡蛋清蛋白与水混匀，搅拌后超高压预处理，随后超声波-微波辅助酶解，酶解结束后升温灭酶，板框压滤收集清液；其中所述超声波-微波辅助酶解包括：在经超高压预处理的混悬液加入混悬液质量2％～5％的碱性蛋白酶并搅拌均匀，同时超声波-微波辅助酶解，酶解后经调pH至6-8，并加入混悬液质量2％～5％的木瓜蛋白酶并搅拌均匀，同时超声波-微波辅助酶解；

(2)：清液冻干后，利用反相高效液相色谱法对冻干粗粉中的目标肽段进行分离，采用4.6×250mm，5μm，238EV54的Everest C18作为反相柱，乙腈水溶液作为流动相，三氟乙酸作为阴离子对试剂，检测波长214nm，上样前纯乙腈冲洗色谱柱，流动相溶解25mg冻干粉定容至25mL，0.45μm微孔滤膜过滤，进样体积20μL，柱温30℃，分离条件为乙腈浓度18％v/v，三氟乙酸浓度0.09％v/v，流速1.0mL/min，保留时间为9.64min、11.36min、13.80min，收集三个洗脱组分，冻干后即为高精氨酸混合肽粉；

(3)：用体积比3:1的浓硫酸和30％双氧水的piranha溶液浸没盖玻片和载玻片，超声清洗1.5～2.5h后，纯水洗净，氮气吹干待用；将洗净的盖玻片浸泡于高精氨酸混合肽水溶液中以获得混合肽固定化模板；将洗净的载玻片浸泡于0.5～1.5％v/v 3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲醇溶液中，20～40rpm振荡15～45min后，甲醇漂洗晾干，获得硅烷化载玻片；将功能单体丙烯酸、甲基丙烯酸，交联剂三乙二醇二甲基丙烯酸酯混匀，加入光引发剂异丙基硫杂蒽酮获得预聚混合液；向预聚混合液中通入氮气后将其平铺于硅烷化载玻片表面，载玻片经旋转后将混合肽固定化模板覆于其上，紫外光引发聚合完成后，将玻片浸泡于8～12％m/v SDS:8～12％v/v HAc溶液中，揭去盖玻片，80～160rpm振荡4～8h后，纯水振荡漂洗至中性，获得高精氨酸混合肽表面印迹膜；

(4)：将步骤(3)获得的高精氨酸混合肽表面印迹膜浸没于步骤(1)获得的清液中，20～40rpm振荡1～6h后取出吸附了目标肽的印迹膜，浸没于0.6～1.2mol/L NaCl溶液中，同时100～300W超声10～50min辅助洗脱；收集洗脱液，通过阳离子交换树脂去除NaCl，透过液经低温喷雾干燥获得高精氨酸混合肽粉末；洗脱后的表面印迹膜经纯水漂洗，再次浸没于步骤(1)获得的新的清液中，重复后续步骤，用于分离高精氨酸混合肽。

2.根据权利要求1所述的高精氨酸混合肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将经脱脂粉碎的核桃粕与鸡蛋清蛋白按质量比3～5:1混合，将此蛋白粕混合物与水按质量体积比1:4～12混匀，室温搅拌1.5～2.5h后置于超高压主机系统中，处理压力200～600MPa，保压时间10～30min，获得经超高压预处理的混悬液；将混悬液控温至40～60℃，调pH至9～10，加入混悬液质量2％～5％的碱性蛋白酶并搅拌均匀，同时超声波-微波辅助酶解，超声功率200～400W，超声时间10～20min，微波功率200～600W，微波时间5～15min，酶解1.5～2.5h后调pH至6～8，加入混悬液质量2％～5％的木瓜蛋白酶并搅拌均匀，同时超声波-微波辅助酶解，超声功率200～400W，超声时间10～20min，微波功率200～600W，微波时间5～15min，酶解2～3h后升温灭酶，板框压滤后收集清液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将洗净的盖玻片浸泡于2～8g/L高精氨酸混合肽水溶液中，20～40rpm振荡4～8h后，纯水漂洗晾干，获得混合肽固定化模板。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将功能单体丙烯酸、甲基丙烯酸，交联剂三乙二醇二甲基丙烯酸酯按体积比1～3:0.5～1.5:4.5～9混匀，加入0.2～0.8体积1～4mmol/L的异丙基硫杂蒽酮的丙酮溶液作为光引发剂，获得预聚混合液。