[发明专利]用于检测奶牛乳房炎6种传染性病原体的LAMP引物组合及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测奶牛乳房炎6种传染性病原体的LAMP引物组合及其应用。本发明首先提供了一种引物组合，由序列1至序列36所示的36种DNA分子组成。所述引物组合可应用于检测待测菌是否为牛支原体、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、牛棒状杆菌或表皮葡萄球菌，可应用于检测待测样本中是否含有牛支原体和/或金黄色葡萄球菌和/或无乳链球菌和/或酿脓链球菌和/或牛棒状杆菌和/或表皮葡萄球菌。本发明提供的引物组合鉴定用于检测奶牛乳房炎6种传染性病原体，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。

技术领域

本发明涉及一种用于检测奶牛乳房炎6种传染性病原体的LAMP引物组合及其应用。

背景技术

奶牛乳房炎是乳区泌乳组织的炎症，通常由细菌感染造成，发病于一到多个乳区，导致产奶量减少，停止产奶，牛奶品质改变。奶牛乳房炎每年影响25-50％的奶牛，是奶牛养殖损失最大的疾病。

奶牛乳房炎由多种非特定的病原微生物引起，目前已发现的约有150多种(包括球菌、杆菌、支原体、真菌或酵母菌、病毒等)，其中较为常见的可分为传染性病原体和非传染性病原体。据报道，全球每年因奶牛乳房炎造成的损失，美国20亿美金，英国2.67亿，日本5亿美元，我国30亿元。平均每个病例损失约200美元左右(约合1200元)，损失主要来自产奶量下降和使用抗生素导致的废弃奶，占到总损失的70％。

目前检验检疫工作中用于检测和鉴定细菌方法主要有传统的分离培养法、PCR、Southern Blot杂交、酶联免疫吸附法(ELISA)等简单的分子生物学和免疫学方法。传统的分离培养、形态观察、生理生化、选择培养基等检测病原菌的方法存在灵敏度低、特异性差、工作量大、耗时长、通量低等显著特点。微生物培养法，耗时长需要3-4d出检测报告，不能满足及时的针对病原体治疗牛乳房炎的目的。免疫学技术(如ELISA)灵敏度高，但容易污染，经常出现假阳性。通常采用一种病原菌一种特异性引物的特定病原体检查的引物特异性PCR技术，虽然可以达到对单一菌的快速、正确和方便的诊断目的，但在病原菌未名时，需要多种不同引物进行试验，这对于病原菌的复杂性和PCR程序的多样性来说显然不够理想。PCR存在检测时间长、易污染、假阳性率高的缺点,使其应用受到限制。以上这些用于病原微生物检测的技术和方法都存在诸多技术问题，而且在实际中由于病原微生物种类繁多，上述方法很难同时对多种病原微生物进行高效的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测奶牛乳房炎6种传染性病原体的LAMP引物组合及其应用。

本发明首先提供了一种引物组合，为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ、引物组Ⅴ和引物组Ⅵ组成；

(a2)由所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ、所述引物组Ⅴ和所述引物组Ⅵ中的任意两个、任意三个、任意四个或任意五个组成；

(a3)所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ、所述引物组Ⅴ或所述引物组Ⅵ。

所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；

所述引物Ⅰ-F3为如下(b1)或(b2)；

(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-B3为如下(b3)或(b4)；

(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；