[发明专利]替度鲁肽串联多肽及替度鲁肽制备方法

权利要求书

1.一种替度鲁肽串联多肽，其特征在于，所述替度鲁肽串联多肽包含两个或更多个替度鲁肽多肽通过接头肽连接而成，在接头处包含酸切和酶切位点；所述替度鲁肽串联多肽的氨基酸序列为MGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(PGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD)_n，所述n＝1，4或者9；

所述酸切位点是天冬氨酸-脯氨酸连接D-P键；所述酶切位点是DDDDK。

2.根据权利要求1所述的替度鲁肽串联多肽，其特征在于，所述替度鲁肽串联多肽的氨基酸组成结构通式为：C₁₉₇H₃₀₇N₅₀O₇₂S₂(C₁₉₇H₃₀₅N₅₀O₇₂S₁)_n，其中n＝1，4或者9。

3.根据权利要求1所述的替度鲁肽串联多肽，其特征在于，所述酸切位点是使用HCl、H₂SO₄、H₃PO₄、醋酸、甲酸、三氟乙酸、醋酸/HCl、醋酸/H₂SO₄、醋酸/H₃PO₄、醋酸/甲酸、或醋酸/三氟乙酸进行酸切的位点。

4.根据权利要求1所述的替度鲁肽串联多肽，其特征在于，所述酶切位点是使用肠激酶、木瓜蛋白酶、Xa因子、凝血酶进行酶切的位点。

5.一种包含表达如权利要求1-4中任一项所述的替度鲁肽串联多肽的核苷酸序列的表达载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是在大肠杆菌中表达的载体。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是pET28a。

8.一种包含如权利要求5-7中任一项所述的表达载体的大肠杆菌。

9.一种使用表达如权利要求1-4中任一项所述的替度鲁肽串联多肽的核苷酸序列在宿主细胞中表达替度鲁肽串联多肽的方法。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌是BL21。

12.一种使用如权利要求1-4中任一项所述的替度鲁肽串联多肽制备替度鲁肽的方法，所述方法包括：

构建包含如权利要求1-4中任一项所述的替度鲁肽串联多肽序列的表达载体；

将所述表达载体在宿主细胞中表达，所述宿主细胞是大肠杆菌，所述表达载体是在大肠杆菌中表达的载体；

将所得的表达产物进行酸切和酶切处理，其中所述酸切是使用HCl、H₂SO₄、H₃PO₄、醋酸、甲酸、三氟乙酸、醋酸/HCl、醋酸/H₂SO₄、醋酸/H₃PO₄、醋酸/甲酸、或醋酸/三氟乙酸；所述酶切是使用肠激酶、木瓜蛋白酶、Xa因子、凝血酶进行；

分离纯化以获得替度鲁肽，通过HPLC进行分离。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述酸切是使用50％醋酸/HCl进行；所述酶切是使用肠激酶进行。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)将菌体加入含或不含Triton X-100的水溶液，通过加热使表达产物释放出来；(b)采用沉淀的方法对表达产物进行粗分离，粗分离产品为沉淀；(c)粗分离产品经过先高温酸切，去除酸溶液，用酶切反应缓冲液溶解后加肠激酶酶切；或先用肠激酶酶切，去除酶切反应缓冲液后高温酸切获得替度鲁肽粗品；(d)替度鲁肽粗品上样于反相层析介质，用含TFA的乙腈溶液洗脱，采用色谱分析，收集并合并含替度鲁肽的洗脱液；(e)取上述步骤中的合并的洗脱液，去除TFA和/或有机溶剂；(f)干燥，即得替度鲁肽。