[发明专利]一种检测galectin‑4的荧光酶联免疫分析方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种检测galectin-4的荧光酶联免疫分析方法。

(二)背景技术

Galectin-4(半乳糖凝集素-4)是β-半乳糖苷结合蛋白，属凝集素家族成员，它具有CRD结构域，与含β-半乳糖苷的糖蛋白和糖脂具有很高的亲和力，在细胞与细胞、细胞与基质之间起到特异性粘附作用，与肿瘤的转移、浸润、生长和粘附密切相关。研究表明，galectin-4的异常表达与某些癌症有关，例如，在某些发生转移的结肠癌、乳腺癌患者血清中的galectin-4含量显著提高；另外，在胰腺癌、肝细胞癌、胃癌患者中galectin-4含量也是上调的。因为galectin-4在癌细胞转移、生长等方面的重要功能，其有望成为重要的靶标分子用于诊断和治疗，所以开发灵敏的选择的检测galectin-4的方法具有重要应用价值。

酶联免疫分析方法是最为常用的一种免疫分析方法，为了达到更好的检测灵敏度，通过纳米材料载体来提高酶与检测抗体的比率是一种常用且有效的方法。目前，已有许多纳米材料如金纳米材料、碳纳米管、石墨烯纳米片、脂质体等材料被用做酶与抗体的载体。但是，这些固定方法有些存在长时间的、共价的修饰或者复杂的组装过程、所用载体成本高等不足，限制了这些方法的应用。所以，开发一种简单、低成本、高效的酶固定方法，有很大应用价值的。

(三)发明内容

本发明目的是基于简单、低成本、高效的酶固定方法，提供一种合成简单、成本低、灵敏度和稳定性高的检测galectin-4的荧光酶联免疫分析方法。

一种检测galectin-4的荧光酶联免疫分析方法，所述方法包括：

(1)合成荧光金纳米簇；

(2)固定葡萄糖氧化酶：先合成葡萄糖氧化酶-金属有机框架复合物GOx/ZIF-8，然后在GOx/ZIF-8外层包裹聚多巴胺壳层得到GOx/ZIF-8-PDA，再修饰上链霉亲和素得到GOx/ZIF-8-PDA-STV；

(3)目标蛋白检测：

i.酶标板以包被稀释液包被目标蛋白，孵育后，再以洗涤液洗板；

ii.加入封闭液进行封闭，再以洗涤液洗板；

iii.加入生物素标记抗体孵育形成抗原-检测抗体特异反应，再以洗涤液洗板；

iv.再加入步骤(2)所得GOx/ZIF-8-PDA-STV孵育，利用链霉亲和素与生物素特异结合将酶复合物链接至抗体上，再以洗涤液洗板；

v.加入1～100mM的葡萄糖溶液孵育反应，20～37℃反应5～60分钟，生成过氧化氢；

vi.将反应液转移至离心管；

(4)在离心管中，分别加入硫酸亚铁溶液和步骤(1)合成的荧光金纳米簇，用荧光光谱仪分别检测溶液荧光值；

(5)梯度浓度的Galectin-4蛋白标准品按照步骤(3)、(4)方法进行检测，处理步骤(4)所得数据，绘制标准曲线；

(6)根据待测蛋白样品的检测结果，对照标准曲线，获得待测蛋白样品的浓度数据。

所述步骤(2)方法如下：将醋酸锌溶液或者硝酸锌溶液或者氯化锌溶液中的一种或者几种二价锌离子混合溶液与2-甲基咪唑溶液混合，锌离子与2-甲基咪唑溶液的摩尔浓度比为10:1～1:10，再加入葡萄糖氧化酶溶液至葡萄糖氧化酶浓度为0.1～10mg/mL，反应30分钟后，离心洗涤收集得GOx/ZIF-8；将GOx/ZIF-8分散于浓度5～50mM的Tris-HCl缓冲液中加入多巴胺溶液至多巴胺终浓度为0.05～10mg/mL，进行自聚合反应10分钟～12小时，离心洗涤收集得GOx/ZIF-8-PDA；将GOx/ZIF-8-PDA与STV溶液于pH 8.0～8.5缓冲液中，STV终浓度为1μg/mL～1mg/mL，共价反应10分钟～12小时，离心洗涤收集得GOx/ZIF-8-PDA-STV。

所述荧光金纳米团簇是以谷胱甘肽为还原剂和保护剂还原氯金酸溶液得到；所述荧光金纳米团簇激发波长为375nm，发射波长为500～700nm，发射峰为610nm。

所述包被稀释液为10mM、pH 7.4的PBS；所述洗涤液组成如下：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，0.05％Tween-20，溶剂为50mM、pH 7.4的PBS；所述封闭液为1％BSA，溶剂为前述洗涤液。