[发明专利]一种杂合抗菌肽突变体CAM‑W融合基因及其重组表达方法

权利要求书

1.一种杂合抗菌肽突变体CAM-W融合基因，其特征在于，以pGJ222为表达载体，以枯草芽孢杆菌WB700为宿主，以天蚕素-蜂毒素杂合抗菌肽突变体CAM-W的基因与猪瘟病毒外壳蛋白突变体EDDIE的基因融合，合成编码EDDIE-CAM-W融合基因的重组表达，所述EDDIE-CAM-W融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的杂合抗菌肽突变体CAM-W融合基因，其特征在于，所述编码EDDIE-CAM-W融合基因的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种如权利要求1或2所述的杂合抗菌肽突变体CAM-W融合基因的重组表达方法，其特征在于，是以pGJ222为表达载体，以枯草芽孢杆菌WB700为宿主，以天蚕素-蜂毒素杂合抗菌肽突变体CAM-W的基因与猪瘟病毒外壳蛋白突变体EDDIE的基因融合，合成编码EDDIE-CAM-W融合基因的重组表达。

4.根据权利要求3所述的杂合抗菌肽突变体CAM-W融合基因的重组表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将天蚕素-蜂毒素杂合抗菌肽突变体CAM-W的基因与猪瘟病毒定点突变外壳蛋白EDDIE和果聚糖蔗糖酶信号肽SacB基因融合，合成编码SacB-EDDIE-CAM-W融合蛋白的融合基因；

(2)用限制性内切酶EcoRI和SacI对SacB-EDDIE-CAM-W融合蛋白的基因进行双酶切，并与用同样限制性内切酶双酶切的表达载体pGJ222质粒连接，构建出自我裂解释放出有生物学活性抗菌肽蛋白的表达载体pDM031；

(3)将大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pDM031转化至大肠杆菌DH5α菌株，获得重组大肠杆菌EWD31菌株，并扩增质粒pDM031；

(4)将在大肠杆菌DH5α菌株中扩增后的pDM031转化至枯草芽孢杆菌WB700菌株，获得可以向胞外表达EDDIE-CAM-W融合蛋白的重组枯草芽孢杆菌BWD31菌株；

(5)通过在液体培养基中培养重组枯草芽孢杆菌BWD31菌株并使用5％麦芽糖诱导，获得分泌到细胞外的EDDIE-CAM-W融合蛋白。

5.根据权利要求4所述的杂合抗菌肽突变体CAM-W融合基因的重组表达方法，其特征在于，步骤(1)中，在EDDIE的DNA序列N-末端连上亲和层析纯化的SacB的DNA序列，在其C-末端连上CAM-W的DNA序列，并在整个融合DNA序列的5’端和3’端分别加上EcoRI和SacI酶切位点及相应保护碱基。

6.根据权利要求4或5所述的杂合抗菌肽突变体CAM-W融合基因的重组表达方法，其特征在于，步骤(5)中，将重组枯草芽孢杆菌BWD31菌株在固体培养基上的单克隆子，接种到含有5μg/ml氯霉素50μg/ml壮观霉素的LB液体培养基中，在37℃、225rpm/min条件下培养10～12h；然后以5％的比例转接到上述含双抗培养基中，在30℃、200rpm/min条件下培养至菌液OD值到1.5～2.0之间，5％麦芽糖诱导12～24h；收集、离心并过滤菌液；通过EDDIE蛋白的自切割功能，即可获得天蚕素-蜂毒素杂合抗菌肽突变体CAM-W的粗蛋白液。