[发明专利]一种罗非鱼枯草芽孢杆菌微生态制剂与饲料

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一株能够抑制无乳链球菌的枯草芽孢杆菌及其应用。本发明筛选到的枯草芽孢杆菌能够显著抑制无乳链球菌的代谢及生长，降低罗非鱼养殖环境中无乳链球菌的数量，控制链球菌病的发生。本发明中枯草芽孢杆菌经过多次菌种选育，并可进行液体深层发酵，菌体经沉降板框过滤后，利用闪蒸干燥工艺，制备成饲料添加剂菌粉，按照比例添加到罗非鱼颗粒料中，制备成含有活菌制剂的饲料产品，改善肠道菌群，提高抗病能力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，筛选到一株能够抑制罗非鱼链球菌的枯草芽孢杆菌，并进行了发酵优化，制备成水剂产品和粉剂产品，并且能在水产饲料中应用。

背景技术

罗非鱼(Tilapia)作为世界水产行业最主要的养殖品种之一，具有生长速度快、食性杂、肉质好、营养价值高、繁殖能力强等优点广泛分布于热带亚热带的淡咸水域中。我国沿海地区特别是海南、广东、福建、云南、广西等省份养殖的罗非鱼产量占世界一半以上。但是近些年来伴随着罗非鱼养殖面积和养殖密度越来越高由无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)感染引起的罗非鱼链球菌病已经成为阻碍我国罗非鱼养殖业健康持续发展的主要因素。近年罗非鱼“链球菌病”呈现出全国爆发的趋势，在每年的高温季节尤其是7-9月份，发病率在50％以上，死亡率最高可达90％以上。

目前多采用抗生素来控制罗非鱼链球菌的发生和传染，这一养殖模式导致了养殖过程中抗生素滥用和残留超标的问题，严重制约了罗非鱼成品的出口和销售，成为限制罗非鱼产业发展的瓶颈问题。

发明内容

本发明从罗非鱼的养殖环境中筛选到一株枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌能够抑制导致罗非鱼链球菌病的无乳链球菌生长，能够显著的控制罗非鱼链球菌病的发生和传染，减少抗生素使用，降低罗非鱼养殖风险，提高罗非鱼的养殖效益。

首先，本发明提供一株能够抑制罗非鱼链球菌病的枯草芽孢杆菌新菌株。

本发明从罗非鱼养殖水域中分离、经定向初筛和复筛得到一株枯草芽孢杆菌。其营养细胞细杆状，其芽孢为椭圆或长杆形，孢子中生，孢囊稍膨大，后期孢子可完全脱落。在LB培养基固体平板上，12～16h内能形成菌落，菌落为圆形，或不规则，边缘毛发状，菌落土黄色，不透明，无褶皱。革兰氏阳性。

利用细菌的通用引物对筛选到的菌株进行PCR鉴定：按细菌DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA。使用16S rRNA保守序列的上游引物5’-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3’(SEQ ID No.2)和下游引物5’-GGT TACCTT GTT ACG ACT T-3’(SEQ ID No.3)扩增细菌16srRNA基因片段。经过测序得到该菌属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，扩增片段的测序结果见SEQ ID No.1。

利用LB培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，对得到的枯草芽孢杆菌CD10进行了抑菌性、耐温性能、发酵特性实验。在平板测试过程中，发现CD10能够显著抑制无乳链球菌的生长，形成显著透明抑制圈。CD10芽孢耐温性能良好，芽孢在85℃水浴10min，芽孢存活率80％以上。

将筛选到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)命名为CD10，于2016年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.12195。

本发明还提供该枯草芽孢杆菌的高密度发酵培养基，其含有KH₂PO₄ 0.8～1.5g/L，蔗糖2～4g/L，豆饼粉8～12g/L，FeSO₄ 0.25～0.5g/L，CaCO₃ 1～3g/L，MgSO₄ 2.5～3.5g/L，玉米面3～5g/L，鱼粉6～10g/L，消泡剂0.05～0.1％，初始pH7.0～7.5。