[发明专利]一种化学发光酶免疫分析法检测尿转铁蛋白的试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测尿转铁蛋白(UTF)含量的试剂盒及其制备方法，涉及化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA)法检测人UTF浓度水平的试剂盒的制备工艺。

背景技术

慢性肾病(CKD)及糖尿病肾病(DN)往往存在发现不及时的特点，很容易引起患者的慢性肾衰竭或尿毒症，是死亡的主要原因。尤其DN，尽管治疗水平已较以往有很大提高，但其仍然是终末期肾病最主要的原因，约占全部终末期肾病病例的44％，因此，早期发现CKD及DN出现的肾损伤，做出早期诊断显得尤为重要。

传统的肾损伤早期诊断方法在各方面都存在一些不足之处，如传统的血肌酐判断肾脏疾病的方法，漏诊率较高，且其结果呈现异常时，肾功往往已经进入失代偿期。尿液的检查因其无痛，无创伤性而有利于临床检验和科学研究。但目前仅常规测量几种尿液参数，例如，肌酐，尿素，白蛋白，血细胞(红细胞、白细胞以及细胞管型等)，细菌，糖，尿胆素原，胆红素和PH值。这些分析对于诊断肾损伤是十分有限的，而且上述指标在其他疾病状态时也会有所改变，缺乏足够的灵敏度和选择性，特别是在肾损伤早期，一些指标的变化并不明显。

目前通过尿液检测早期肾损伤的方法是定期检测尿中白蛋白及β2-微球蛋白，但有研究及临床观察发现，在肾损伤早期，患者UTF的变化升高比尿微量白蛋白和β2-微球蛋白的升高更为明显，是观察早期肾损伤的更理想的指标。

转铁蛋白是血浆中的一种含铁蛋白质，分子量7.65KDa，在肝脏中形成，和白蛋白相似，均为带负电荷的小分子循环蛋白，但转铁蛋白的等电点较白蛋白高，带有更多的负电荷，而肾小球滤过膜富含的硫酸肝素糖蛋白、唾液酸糖蛋白带有大量负电荷，当转铁蛋白通过滤过膜时，受到的电荷排斥力较白蛋白小，故它较后者容易漏出，因而也更能敏感地反映肾小球电荷屏障的受损。研究证实，UTF在肾病患者中的增高具有显著的相关性，能更敏感地反映肾小球的损伤，其增高程度与肾脏病变的严重程度相关联。

目前市场中检测UTF的方法有胶体金法、酶免法(EIA)、免疫比浊法和放免法(RIA)。其中胶体金法灵敏度较低，易出现假阳性，其结果易受主观因素的影响；免疫比浊法特异性较差；酶联免疫检测法灵敏度低。

化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)，是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。化学发光免疫分析技术包含两个部分，即免疫反应技术和化学发光分析。化学发光分析是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子(hM)，利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应技术将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原(化学发光免疫分析)或抗体(免疫化学发光分析)上，或酶作用于发光底物。本发明是采用化学发光法中的化学发光酶免疫分析(CLEIA)法检测人UTF的含量。

CLEIA法以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)，它们有各自的发光底物。

辣根过氧化物酶(HRP)标记的CLEIA常用的底物为鲁米诺(luminol)，或其衍生物如异鲁米诺，是一类重要的发光试剂。鲁米诺及与其配套使用的HRP价格便宜、来源方便是其一大优点，但存在发光效率低的缺点，因此本发明利用增强剂来增加发光信号的强度，延长发光时间，在考虑低成本、便利性的同时提高反应的灵敏度和稳定性。本发明发光底物反应体系采用鲁米诺/H₂O₂/HRP/对碘苯酚系统。

发明内容

本发明试剂盒采用的化学发光酶免疫分析法，首先用HRP标记抗UTF抗体，包被于抗体包被板后与添加的UTF抗原反应形成免疫复合物，再加入化学发光底物液，即可测量化学发光反应的相对光单位(RLU)；标准品/样本中UTF的含量和光学系统所测量出的相对光单位(RLU)成正比关系，通过标准曲线拟合，从而对可对尿液标本中UTF含量进行定量测定。

本发明试剂盒主要由抗体包被板及各反应试剂组成，所有反应均在抗体包被板的微孔中进行。

本发明试剂盒中的反应试剂配方如下：