[发明专利]抑制小鼠Iqcf5基因表达的shRNA及其干扰重组表达载体、构建方法和应用

说明书

本发明公开了抑制小鼠Iqcf5基因表达的shRNA，该shRNA为shRNA‑Iqcf5‑107、shRNA‑Iqcf5‑257、shRNA‑Iqcf5‑425或shRNA‑Iqcf5‑500，它们分别具有序列表ＳEQ.ID.No.1、3、5、7的碱基序列。据此，发明人还建立了Iqcf5基因的真核表达载体、shRNA干扰重组表达载体及其构建方法。实验证实，shRNA‑Iqcf5‑257和shRNA‑Iqcf5‑500均能有效的干扰小鼠Iqcf5基因的表达，这对于Iqcf5基因功能的研究奠定了基础，同时也展示了在研究特发性不育症的病因及男性不育症靶向治疗和男性避孕方面的应用前景。

技术领域

本发明属于小鼠Iqcf5基因，尤其涉及一种抑制小鼠Iqcf5基因表达的shRNA及其干扰重组表达载体、构建方法和应用。

背景技术

精子发生是一个复杂精细的过程，在此过程中存在着严格的同源群现象和周期变化规律，受众多因素的协同调控。然而，对于哺乳动物精子发生的分子事件人们依然知之甚少。近年来，受各种因素影响，越来越多的人受到不育症的困扰，其中一半左右是男性不育。相当比例的男性不育症患者的睾丸不能产生精子，通常被称为非梗阻性无精子症(NOA)，多项研究显示NOA与遗传有关。因此，近年来与男性不育密切相关的基因突变或多态现象也相继被发现并日益成为研究热点。尽管如此，到目前为止，对于精子发生的分子机理依然所知不多。对调控精子发生相关基因的深入研究，不仅有助于阐明特发性不育症的病因，而且对于男性不育症靶向治疗的发展和男性避孕有重要的理论及应用价值。

钙调蛋白(CaM)是一个钙离子传感器，在很多生命活动中发挥重要作用，但其本身并没有任何酶活性，只是通过与钙调蛋白结合蛋白相互作用来调节靶蛋白的活性。钙调蛋白结合蛋白一般都包含三种典型的钙调蛋白结合结构域，其中一种是在特定位点有保守的异亮氨酸(Ile)和谷氨酰胺(Gln)的IQ结构域(IQ motif)。已知的具有IQ结构域的蛋白在很多生物功能方面发挥重要作用，包括神经元生长蛋白，电压门控通道，肌球蛋白，磷酸酶，Ras交换蛋白，精子表面蛋白，纺锤体相关蛋白等。研究表明，具有IQ结构域的蛋白在小鼠生殖方面也发挥重要功能。精子表面蛋白SP17具有保守的IQ基序的蛋白，Ying等发现SP17与小鼠的精子穿透和精卵结合过程有关。Harris等发现，Iqcg基因可能与小鼠精子尾部的形态发生有关，Iqcg基因的敲除会导致雄性小鼠不育。Fang等的研究表明Iqcf1基因在雄性小鼠睾丸和附睾中高表达，且特异表达于小鼠睾丸精子和成熟精子的顶体上。Iqcf1基因被敲除的小鼠明显表现为精子活率下降，顶体反应率下降。Iqcf4基因也被发现高表达于小鼠的睾丸组织中，且特异表达于小鼠睾丸的精母细胞，但Iqcf4基因在雄性小鼠的生殖方面作用的方式还不是很清楚。而Iqcf5蛋白也是包含两个IQ基序的钙调蛋白结合蛋白，且与Iqcf1基因具有高度同源性，因此其在雄性小鼠生殖方面可能发挥重要作用。

RNAi是基因功能研究的有力工具，可用于研究动物生殖过程中相关基因的调控机制，从而解决体外研究基因功能的问题。但由于动物的繁殖过程要受到诸多因素的影响和调控，其分子机制也不甚明了，而且对于RNAi的具体机制也尚未完全阐明，因此，目前在哺乳动物上应用RNAi技术的效率也不是太高。要提高RNAi的效率还必须不断摸索，而干扰过程中最关键的就是对有效的siRNA序列的选择。对动物生殖过程分子机制了解的不断深入才是解决目前由于遗传等因素造成的雄性不育的根本途径，因此，必须从分子遗传学的角度对生殖相关基因进行研究，从而为不育症的治疗奠定基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种抑制小鼠Iqcf5基因表达的shRNA及其干扰重组表达载体、构建方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：抑制小鼠Iqcf5基因表达的shRNA，该shRNA为shRNA-Iqcf5-107、shRNA-Iqcf5-257、shRNA-Iqcf5-425或shRNA-Iqcf5-500，它们都包含21nt的siRNA正义链，9nt的loop环，21nt的反义链和终止信号；