[发明专利]一种林蛙皮透明质酸的提取方法

权利要求书

1.一种从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，包括：

(1)获取林蛙皮粉；

(2)利用蒸馏水对所述林蛙皮粉进行溶解，以便得到林蛙皮粉溶解液；

(3)将所述林蛙皮粉溶解液在超高压容器内进行超高压处理，以便得到超高压浸出液；

(4)利用胰酶和碱性蛋白酶对所述超高压浸出液进行酶解处理，以便得到酶解液；

(5)向所述酶解液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀并进行干燥处理；

(6)利用0.1-0.5mol/L氯化钠对经过所述干燥处理后的沉淀进行溶解；

(7)向溶解的沉淀中添加过氧化氢进行脱色处理；

(8)调节经过所述脱色处理后的溶液的pH至4.5-5.0，并加入氯仿和正丁醇的混合溶液，搅拌4h，离心分离出蛋白并收集水相；

(9)利用磷酸盐缓冲液对所述水相进行透析，收集透析液；

(10)向所述透析液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀并进行干燥处理，以便得到透明质酸精品；

其中步骤(3)中，所述超高压处理是在200-400Mpa的压力下保持2-5min，并在2s内卸除压力而完成的；

步骤(4)中，所述酶解处理按照下列步骤进行：

(4-1)调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第一酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第一酶解液；

(4-2)向所述第一酶解液中添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第二酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第二酶解液；

或者所述酶解处理按照下列步骤进行：

(4-1)调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第一酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第一酶解液；

(4-2)向所述第一酶解液中添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第二酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第二酶解液。

2.根据权利要求1所述的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述溶解按照下列步骤进行：

(2-1)将所述林蛙皮粉溶于蒸馏水中，磁力搅拌4-8h，于4℃冰箱放置至少12h；

(2-2)将步骤(2-1)得到的溶液在20-35KHz和100-300W条件下超声处理20-30min，以便得到林蛙皮粉溶解液。

3.根据权利要求1所述的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，步骤(5)和步骤(10)中的干燥处理是在40-60℃的真空干燥箱中进行的。

4.根据权利要求1所述的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，步骤(7)中，所述脱色处理是通过向溶解的沉淀中添加0.5-1.5体积％的过氧化氢、并调节pH至7.0-7.5，于40-60℃的水浴中进行4-10h完成的。

5.根据权利要求1所述的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，步骤(8)中，向所述脱色处理后的溶液中加入等体积的所述混合溶液。

6.根据权利要求1所述的从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，所述混合溶液中氯仿与正丁醇的体积比为4：1。

7.一种从林蛙皮中提取透明质酸的方法，其特征在于，包括：

(1)获取新鲜剥离的林蛙皮，除去皮下组织及粘连物，清洗，室温干燥，粉碎，以便获得林蛙皮粉；

(2)溶解：将所述林蛙皮粉按照1g：10ml的质量体积比溶于蒸馏水中，磁力搅拌4-8h，于4℃冰箱放置至少12h；

(3)超声波处理：将步骤(2)得到的溶液在20-35KHz和100-300W条件下超声处理20-30min，以便得到林蛙皮粉溶解液；

(4)超高压处理：将所述林蛙皮粉溶解液在200-400Mpa的压力下保持2-5min，并在2s内卸除压力完成超高压处理，以便得到超高压浸出液；

(5)酶解：调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第一酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第一酶解液；向所述第一酶解液中添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第二酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第二酶解液，或者

调节所述超高压浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的碱性蛋白酶并于50℃的水浴中进行第一酶解3-6h，沸水浴灭活所述碱性蛋白酶，以便得到第一酶解液；向所述第一酶解液中添加1％的胰酶并于37℃的水浴中进行第二酶解2-4h，沸水浴灭活所述胰酶，以便得到第二酶解液；

(6)浓缩：向所述酶解液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀，将沉淀在40-60℃的真空干燥箱中进行干燥处理；

(7)利用0.1-0.5mol/L氯化钠对经过所述干燥处理后的沉淀进行溶解；

(8)向溶解的沉淀中添加0.5-1.5体积％的过氧化氢并于40-60℃的水浴中进行脱色处理4-10h；

(9)调节经过所述脱色处理后的溶液的pH至4.5-5.0，并加入等体积的氯仿和正丁醇的混合溶液，搅拌4h，离心分离出蛋白并收集水相，所述混合溶液中氯仿与正丁醇的体积比为4：1；

(10)利用pH 7.0的50mmol/L的磷酸盐缓冲液对所述水相进行透析，收集透析液；

(11)向所述透析液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀并将沉淀在40-60℃的真空干燥箱中进行干燥处理，以便得到透明质酸精品。