[发明专利]一种高效的宫膜干细胞分离提取方法及建库方法

说明书

本发明公开了一种高效的宫膜干细胞分离提取方法及建库方法，本发明将月经血样品经过密度梯度离心得到的底部沉淀洗涤后贴壁培养，收获宫膜干细胞。本发明采用传统方法中密度梯度离心后废弃的底部沉淀分离得到的宫膜干细胞数量是传统白膜层的十倍左右，收获的大量宫膜干细胞扩增培养后可建立宫膜干细胞库。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及宫膜干细胞的分离提取和宫膜干细胞库的建立。

背景技术

1999年，《Science》将人类胚胎干细胞研究成果评为当年世界十大科技进展之首，2000年，《Time》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首，并认为胚胎干细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域。至此干细胞研究成为近年来生物学以及医学领域中最引人注目的热点之一。干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。目前干细胞来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞，但这两种来源都存在着部分局限性，因此寻找一种克服肿瘤形成的潜在性、标本来源的缺乏及伦理学争议等弊端的干细胞来源具有重要意义。近年来，美国Musina领导的研究小组从健康女性的月经血中得到分离的干细胞。宫膜干细胞(MenSCs)避免了其他干细胞的不足，成为一种全新的具有重大研究和应用潜力的干细胞。

然而，经对现有技术文献和专利的检索发现(如中国专利申请号201110085328.4和201210116237.7)，现有报道的宫膜干细胞获取方法中主要使用密度梯度离心的方法，但是会过滤去除组织块，传统的密度梯度离心收获到的仅为白膜层的单个核细胞，而脱落的组织块则会沉淀在底部废弃掉，该方法收获到的细胞数量较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效的宫膜干细胞分离提取方法及建库方法，以解决现有技术中的宫膜干细胞分离提取方法产量较低的缺陷。

本发明的发明人根据宫膜干细胞来源于脱落的宫膜组织，但并非所有宫膜干细胞都会变为单个核细胞，还存在脱落的宫膜组织块的原理，通过不断摸索，将底部沉淀洗涤后贴壁培养，宫膜组织块中的宫膜干细胞会呈克隆状贴壁，由此收获的干细胞的数量约为传统方法收获到的数量的10倍左右，大大提高了宫膜干细胞分离提取的效率，为宫膜干细胞建库提供大量的宫膜干细胞资源。

本发明的技术方案如下：

一种高效的宫膜干细胞分离提取方法，将月经血样品经过密度梯度离心后得到的底部沉淀洗涤后贴壁培养，收获宫膜干细胞。

优选地，所述密度梯度离心，其方法是在人淋巴细胞分离液上缓慢添加等体积的月经血样品，15℃-25℃的温度下，300-500g的转速，离心20-40分钟。

优选地，所述底部沉淀的洗涤，其方法是使用10倍体积的缓冲液冲洗，重复三次。

优选地，所述的月经血样品，是指女性月经周期第二天或第三天的月经血，添加等体积的含一种或多种抗菌物质的缓冲液。所述缓冲液也称为月经血保存液。

优选地，所述抗菌物质选自两性霉素、青霉素、头孢拉定、头孢唑啉、头孢羟氨苄、头孢呋辛、头孢噻吩、链霉素、妥布霉素、四环素、土霉素、琥乙红霉素、克拉霉素、乙酰螺旋霉素、阿奇霉素、罗红霉素、红霉素、克林霉素和林可霉素中的一种或几种。

优选地，所述贴壁培养包括原代培养和传代扩增。

优选地，宫膜干细胞的原代培养方法为：将分离洗涤后得到的底部沉淀中的目标细胞用10ml含10％-20％的血清的α-MEM重悬，放在平皿中在37℃、5％CO2的条件下静置培养，24小时后，用10ml缓冲液洗涤3次，更换10ml新鲜的培养液，以后每3天全换液一次；细胞长满约80％-90％时，消化，之后进行传代。

优选地，宫膜干细胞的传代扩增步骤包括：原代培养方法中传代后的宫膜干细胞，每两天全换液一次，细胞长满约80％-90％时，消化，并继续传代。