[发明专利]一种基于复合PCR技术的大蒜中致病菌定性检测的方法

权利要求书

1.用于鉴定大蒜中常见致病菌的1套复合PCR引物引物，其特征在于，包括4对引物，分别为：

用于检测灰葡萄孢霉菌B.cinerea Pers的1对引物：上游引物序列B.c-F:5’-ATTTGGCTTCGCTGCTGT-3’，下游引物序列B.c-R:5’-GCGGTGGTATCTCGCTCT-3’，PCR产物大小162bp；

用于检测葱鳞葡萄孢霉菌B.squamosa Walker的1对引物，上游引物序列B.s-F：5’-ATACTCCGCCATTAGCCC-3’，下游引物序列B.s-R：5’-GCCGCCAACGATCTCAAA-3’，PCR产物大小244bp；

用于检测链格孢菌Alternaria alternata的1对引物，上游引物序列A.a-F:5’-TGACCCGCACATACAACT-3’，下游引物序列A.a-R:5’-CAACCACCTTTCCAGAGCPCR-3’，产物大小380bp；

用于检测胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides(penz.)sacc.的1对引物，上游引物序列C.g-F：5’-CGGCTAGAACAGGACATT-3’，下游引物序列C.g-R：5’-CAGAAGTTGGGGATTGAC-3’，PCR产物大小455bp。

2.一种采用权利要求1所述引物，基于复合PCR技术的大蒜中致病菌的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)使用微生物DNA提取试剂盒，提取大蒜中附着和增殖的微生物基因组DNA，为供试品DNA模板，稀释至50ng/μL备用。

(2)采用权利要求1所述的复合PCR引物，对供试品DNA模板进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为20μL，扩增反应体系为： Master Mix 5μL，4对引物上游和下游引物10μmol/L各0.2μL，供试品DNA模板(50ng/μL)1μL，双蒸水补足20μL；PCR反应程序为94℃预变性5min，35个扩增循环(94℃30sec，55℃20sec，72℃45sec)；72℃延伸7min。

(3)按20g/L的质量浓度制备琼脂糖溶液。取12μL PCR产物加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm～5V/cm条件下电泳检测。电泳结束后，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。

(4)凝胶成像后，依据DNA分子量标准计算供试品PCR产物大小，依据电泳条带大小判断致病菌检出情况，其中162bp、244bp、380bp和455bp处条带分别代表检出灰葡萄孢霉菌、葱鳞葡萄孢霉菌、链格孢菌和胶孢炭疽菌。