[发明专利]一种串联RAD标签测序文库的构建方法

权利要求书

1.一种串联RAD标签测序文库的构建方法，其特征在于，步骤为：

1）酶切：利用选定内切酶对N个基因组DNA分别进行酶切反应，获得N份酶切片段，所述N为大于2的整数；

2）接头连接：对所述N份酶切片段分别连接接头，即设计N对接头组合，得到N份连接产物，每份酶切片段两端连接的接头均设计有SapI酶的酶切位点和用于实现标签串联的特征序列以及扩增引物结合的通用序列，根据所添加的接头决定了N组酶切片段的串联顺序；

3）连接产物扩增：将步骤2）所得到的N份连接产物分别利用不同的生物素引物和普通引物组合进行PCR扩增，富集连接有接头的酶切片段，切胶回收PCR产物，采用同样的方法扩增4-8个循环，扩增后得到N份富集的PCR产物；将所述N份富集的PCR产物等量混合，并进行纯化；

4）串联标签文库：利用SapI酶对混合并纯化后的N份PCR产物进行酶切，切除了酶切片段两端通用的接头和引物序列，使接头上带有的特征序列保留并形成末端粘性突出，N份PCR产物形成了可直接串联的标签，根据接头上的特征序列互补配对，使N份标签文库按照顺序依次串联，得串联长标签；

5）串联长标签富集：将所述串联长标签经凝胶纯化后利用引物进行PCR扩增，引入barcode构建串联标签文库；

6）文库测序：将所述串联标签文库利用Illunima测序平台进行测序。

2.根据权利要求1所述的一种串联RAD标签测序文库的构建方法，其特征在于，所述步骤1）中内切酶是IIB型限制性内切酶、甲基修饰依赖型内切酶中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的一种串联RAD标签测序文库的构建方法，其特征在于，步骤2）中所述接头的设计特征在于，设计五对接头组合，五对接头组合分别为Ada1a和Ada1b，Ada2a和Ada2b，Ada3a和Ada3b，Ada4a和Ada4b，Ada5a和Ada5b，每个接头由两个核苷酸片段组成，接头Ada1a和Ada5b的序列中SapI的酶切位点设计了一个碱基的突变，不能被酶切，利用SapI酶对五种混合标签的PCR产物酶切时，酶切标签的两端接头Ada2a和Ada2b、Ada3a和Ada3b、Ada4a和Ada4b以及Ada1b和Ada5a侧的接头及引物通用序列能被SapI酶切除，使五种标签片段两侧带有的三碱基特征序列形成末端粘性突出，根据特征序列的互补配对，实现五种标签首尾依次串联，即Ada1b端与Ada2a端连接，Ada2b端与Ada3a端连接，Ada3b端与Ada4a端连接，Ada4b端与Ada5a端连接，从而形成串联标签，而串联标签上Ada1a和Ada5b接头端的通用序列仍然保留，为下一步串联标签的扩增富集提供引物的结合点。

4. 根据权利要求3所述的一种串联RAD标签测序文库的构建方法，其特征在于，所述步骤2）中，构成Ada1a的两个核苷酸片段，其序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；构成Ada1b的两个核苷酸片段，其序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；构成Ada2a的两个核苷酸片段，其序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；构成Ada2b的两个核苷酸片段，其序列分别为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；构成Ada3a的两个核苷酸片段，其序列分别为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；构成Ada3b的两个核苷酸片段，其序列分别为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；构成Ada4a的两个核苷酸片段，其序列分别为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；构成Ada4b的两个核苷酸片段，其序列分别为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；构成Ada5a的两个核苷酸片段，其序列分别为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18；构成Ada5b的两个核苷酸片段，其序列分别为SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。

5.根据权利要求4所述的一种串联RAD标签测序文库的构建方法，其特征在于，所述步骤3）中生物素引物和普通引物组合的选择对应步骤2）中的接头组合，接头1连接的酶切片段使用引物Prim1和BioPrim1扩增，接头2、3、4连接的酶切片段使用引物BioPrim1和BioPrim2扩增，接头5连接的酶切片段使用引物BioPrim1和Prim2扩增。