[发明专利]一种DNApulldown方法及试剂盒

权利要求书

1.一种DNA pulldown方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1、磁珠预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；

所述步骤S1磁珠预处理的方法为：用1mL 1×TES洗涤80μL链霉亲和素标记的磁珠，去除TES洗涤液，再向磁珠中加入1mL含BSA和寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后去除TES溶液；

所述TES中BSA的浓度为0.05-0.5wt%，寡核苷酸随机引物的浓度为10-20μmol/L；

所述步骤S1中寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列；

S2、制备探针-磁珠复合物：将步骤S1预处理的磁珠与生物素标记的DNA探针结合；

S3、提取并预处理细胞核蛋白：向提取核蛋白样品中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入未预处理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；

所述步骤S3提取细胞核蛋白的方法为：用含0.5mM PMSF的PBS洗涤1.5×10⁷个细胞两次，每次4℃、1000rpm离心5min，弃上清；加入390μL预冷Buffer 1、4μL 10mg/mL 的PMSF溶液、4 μL protease inhibitor cocktail和2 μL100mM DTT溶液，重悬细胞后，剧烈涡旋10秒钟充分混匀，冰浴10min；4℃、1400g-2500g离心5min，弃上清；加入390μL冷Buffer 2、4μL 10mg/mL 的PMSF溶液、4μL protease inhibitor cocktail和2μL 100mM DTT溶液，涡旋充分重悬沉淀，冰浴20min，每隔2min高速剧烈涡旋15-30秒钟充分混匀；4℃、12,000g-16,000g离心10min，弃沉淀，上清为核蛋白提取物；所述Buffer1的配方为：10 mM HEPES-KOH、1.5 mM MgCl₂、10 mMKCl、0.1mMEDTA和0.4wt% NP-40；所述Buffer 2的配方为50 mM HEPES-KOH、5 mM MgCl₂、420 mMNaCl、0.1 mM EDTA和2wt% glycerol；

S4、pulldown：将步骤S3制备的蛋白样品加入到步骤S2制备的探针-磁珠复合物中，加入DNA precipitation buffer及脱氧核糖核酸酶抑制剂孵育，收集磁珠，用DNA precipitation buffer洗涤磁珠，得到蛋白-探针-磁珠复合物；

S5、探针-蛋白复合物的收集：将步骤S4制得的蛋白-探针-磁珠复合物加入Urea CHAPS buffer孵育，去除磁珠，收集上清即得探针-蛋白复合物。

2.根据权利要求1所述的DNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S2制备探针-磁珠复合物的方法为：向2-5μg DNA探针中加入DNA structure buffer至100μL，再将其加入步骤S1中预处理的磁珠中，并加入100μL 2×TES，25℃温和旋转混合30-60min，去上清；用1×TES洗涤磁珠两次，去除TES。

3.根据权利要求1所述的DNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S3中预处理细胞核蛋白的方法为：向1.5×10⁷个细胞提取获得的核蛋白提取物中加入5μL DNase和1.6μL DNase Buffer，25℃温和孵育1h；再加入40 μL未预处理的磁珠，4℃温和旋转30 min；上清液为预处理的核蛋白。

4.根据权利要求1所述的DNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S4 pulldown的具体方法为：将步骤S3制备的核蛋白加入到探针-磁珠复合物中，并加入465μL DNA precipitation buffer、5μL protease inhibitor cocktail、15μg poly(dI•dC)、5μL 10mg/mL 的PMSF溶液、2.5μL 100mM DTT溶液、5μL 0.5 M EDTA溶液和2.5μL 0.5M EGTA溶液；4℃旋转混合孵育30-60min，收集磁珠，4℃，加入975μL DNA precipitation buffer、10μL 10mg/mL 的PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail和5μL 100mM DTT溶液，洗涤磁珠，再重复洗涤四次。

5.根据权利要求1所述的DNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S5蛋白样品的收集方法为：向蛋白-探针-磁珠复合物中加入40μL Urea CHAPS buffer 和0.4μL 100mM DTT溶液，4℃孵育5-10h，上清即为探针-蛋白复合物。