[发明专利]一种RNApulldown方法及试剂盒

权利要求书

1.一种RNA pulldown方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1、磁珠预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；

所述步骤S1磁珠预处理的方法为：用1mL 1×TES洗涤80μL链霉亲和素标记的磁珠，去除TES洗涤液，再向磁珠中加入1mL含BSA和寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后去除TES溶液；

所述TES中BSA的浓度为0.05-0.5wt%，寡核苷酸随机引物的浓度为10-20μmol/L；

所述步骤S1中寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列；

S2、制备探针-磁珠复合物：将步骤S1预处理的磁珠与生物素标记的RNA探针结合；

S3、提取并预处理细胞全蛋白：向提取的细胞全蛋白中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入未预处理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；

所述步骤S3中预处理细胞全蛋白的方法为：向1.5×10⁷个细胞提取获得的细胞全蛋白提取物中加入10μL DNase和3.2μL DNase Buffer，室温温和孵育1h；再加入40μL未预处理的磁珠，4℃温和旋转30 min；收集上清液为预处理的细胞全蛋白；

S4、pulldown：将步骤S3收集的上清加入到步骤S2制备的探针-磁珠复合物中，加入脱氧核糖核酸酶抑制剂和核糖核酸酶抑制剂孵育，收集磁珠，用含核糖核酸酶抑制剂的NT2 buffer洗涤磁珠，得到蛋白-探针-磁珠复合物；

S5、RNP的收集：将步骤S4制得的蛋白-探针-磁珠复合物加入Urea CHAPS buffer孵育，去除磁珠，收集上清即得RNP。

2.根据权利要求1所述的RNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S2制备探针-磁珠复合物的方法为：将含2-5μg生物素标记RNA探针的溶液在90℃放置2min，立即置于冰上2min，加入50μLRNA structure buffer和20μL DEPC水，室温放置20min制备得到二级结构的RNA探针；将其加入预处理的磁珠中，并加入100μL 2×TES，25℃温和旋转混合30-60min，去上清；用1×TES洗涤磁珠两次，去除TES。

3.根据权利要求1所述的RNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S3提取细胞全蛋白的方法为：用PBS洗涤1.5×10⁷个细胞一次；加入975μLRIP Buffer、10μL PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail和5μL DTT溶液，匀浆15-20次；4℃、1500g离心15min，收集上清即为细胞全蛋白提取物。

4.根据权利要求1所述的RNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S4 pulldown的具体方法为：将步骤S3制备的细胞全蛋白加入到探针-磁珠复合物中，并加入472.5μL NT2 buffer、5μL RNase inhibitor、15μg poly(dI•dC)、5μL 0.5 M EDTA溶液和2.5μL 0.5M EGTA溶液；室温温和旋转孵育2h，收集磁珠；加入974μL NT2 buffer、10μL PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail、5μL DTT溶液和1μL RNase inhibitor，洗涤磁珠，再重复洗涤四次。

5.根据权利要求1所述的RNA pulldown方法，其特征在于，所述步骤S5中RNP的收集方法为：向蛋白-探针-磁珠复合物中加入40μL Urea CHAPS buffer，4℃孵育5-10h，收集上清即为探针-蛋白复合物。