[发明专利]一种分子佐剂加强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗

说明书

本发明涉及一种用于预防鸡马立克氏病的蛋白工程疫苗的制备方法及其应用。所述疫苗含有鸡马立克氏病病毒MDV主要结构蛋白糖蛋白B的亚单位、杀伤性T细胞表位、多个B细胞抗原表位以及鸡γ干扰素和纯化标签。所述疫苗生产制备工艺稳定，经过靶动物SPF鸡动物实验表明本发明所述的蛋白工程疫苗使用安全，能有效预防鸡马立克氏病病毒的感染。

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种与分子佐剂共表达的用于预防鸡马立克氏病的融合蛋白。具体地，利用基因重组技术，将主要结构蛋白gB蛋白亚单位，杀伤性T细胞表位及多个B细胞抗原表位与分子佐剂多肽(IFN-γ)串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺得到共表达的免疫效果增强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗以及该疫苗在预防鸡马立克氏病中的应用。

背景技术

马立克病(Marek′s Disease，MD)是一种常见的鸡淋巴组织增生性疾病，具有高度传染性，感染鸡产生肿瘤或死亡，病理上以外周神经、性腺、虹膜、各种脏器和皮肤组织发生单核细胞浸润为主要特征。是危害养鸡业最为严重的传染病之一，给养禽业造成巨大的经济损失。本病可通过与病鸡或带毒鸡直接或间接接触经气源传播，在羽囊上皮细胞中复制的传染性病毒，随羽毛、皮屑排出，使污染鸡舍的灰尘成年累月保持传染性。MD存在于世界所有养禽国家和地区，其危害随着养鸡业的集约化而增大，鸡群中一旦发生此病，即可引起大批死亡，受害鸡群的损失以1％-30％不等，个别鸡群高达50％以上，尤其是出雏和育雏室的早期感染可导致很高的发病率和死亡率，是我国三大重点控制的疫病之一。

马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)属于α疱疹病毒亚科马立克病毒属(Mardivirus)禽疱疹病毒2型(Gallid herpesvirus)，是一种细胞结合型病毒。MDV分3个血清型：I型为致瘤的MDV；II型为不致瘤的MDV；III型为HVT。MDV基因组编码许多蛋白，作为病毒粒子的成分，这些结构蛋白根据它们在病毒粒子中的位置分为三组：衣壳蛋白、衣被蛋白和囊膜蛋白。其中糖蛋白B基因gB在疱疹病毒中是高度保守的，由UL27编码，长度为805aa，分子量理论值为95.5KD。MDV gB胞外区(22aa-682aa)含有抗原表位、穿膜、入胞及中和作用的区域，gB蛋白是一组分子量为gp100、gp60、gp49构成的糖蛋白复合物，是一种非分泌性的抗原，抗原位于感染细胞的膜表面和胞浆中，以及病毒颗粒的被膜上，以多种形式存在，它既可以引起体液免疫又可以引起细胞免疫，因而在MD基因工程疫苗研制中成为十分重要的保护性抗原。

疫苗接种是预防马立克氏病的关键，目前用于制造疫苗的病毒有三种：人工致弱的I型MDV(如CVI988)、自然不致瘤的II型MDV(如SB1、Z4)和III型MDV(HVT)(如FC126)。HVT属无毒力MDV，其最大的优势在于通过对培养细胞的超声破碎，可得到大量游离病毒，使用和运输比较方便，造价便宜，可以提供较好的免疫保护，但比某些其他血清型疫苗株要差一些。80年代初，美国开始将血清II型疫苗株(SB-1)与血清III型疫苗株(HVT)联合成二价苗使用，发现二价苗可比单价苗提供更好的免疫保护，随后又出现了三种血清型两两组合的各种二价苗及三价苗，如301B/1+HVT、814+HVT、Md11/75+SB-1+HVT等。多价苗是细胞结合型苗，病毒在细胞内能有效避免母源抗体的干扰，同时产生的免疫力较单价苗早，可以抵抗超强毒株的攻击，然而多价苗也存在一些隐患，血清II型病毒会明显增加某些品系鸡的淋巴性白血病的发病率和死亡率，且细胞结合型苗需在液氮条件下保存，给产品的保存、运输及使用带来诸多不便。随着强毒株、超强毒株的不断发现，现有传统疫苗已不能发挥有效的保护作用，迫切需要研发新型安全有效，便于储存及运输的疫苗。