[发明专利]一种快速检测乙肝环状DNA的方法

说明书

本发明公开了一种快速检测乙肝环状DNA的方法。本发明快测HBV cccDNA的方法，步骤如下：Ⅰ、采用HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球分离富集HBV cccDNA；Ⅱ、扩增和纯化HBV cccDNA；Ⅲ、快测；其中，HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的制备的法如下：(1)采用化学共沉淀的制备Fe₃O₄纳米粒子；(2)采用反相乳液的制备硅壳磁性纳米颗粒；(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰；(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针。本发明的法可以有效快测HBV cccDNA，特异性和灵敏度高，临床应用前景良好。

技术领域

本发明涉及一种富集分离和快速检测乙肝环状DNA的方法。

背景技术

慢性乙型肝炎是由于感染乙型肝炎病毒(HBV)引起的疾病，目前尚无特效药能够治愈。而HBV cccDNA是乙肝病毒持续感染、难以治愈的关键因素，通过检测HBV cccDNA可以了解HBV感染状态及传染性，评价药物治疗HBV的疗效，帮助了解机体清除HBV的程度，为临床医生判断何时停止抗病毒治疗及停止治疗后HBV是否会重新复制活跃导致乙肝复发提供一个客观指标，也是评价肝外组织是否被HBV感染以及在肝移植中评价移植肝脏是否被再感染的指标。

国内外学者已建立了许多检测HBV cccDNA的方法，如，Southern印迹杂交法、PCR法等等。但是这些方法的特异性和灵敏度均不理想。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高特异性和高灵敏度的检测HBV cccDNA的方法。

本发明检测HBV cccDNA的方法，骤如下：

I、采用HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球分离富集HBV cccDNA；

II、扩增和纯化HBV cccDNA；

III、检测；

其中，HBV cccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的制备方法如下：

(1)采用化学共沉淀法制备Fe₃O₄纳米粒子；

(2)采用反相乳液法制备硅壳磁性纳米颗粒；

(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰；

(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针。

所述步骤(1)的方法如下：将1.0mol/L FeCl₃溶液与2.0mol/L FeCl₂溶液混合，FeCl₃溶液与FeCl₂溶液的体积比为4∶1，加入FeCl₂溶液25倍体积的浓度为0.7mol/L的氨水溶液，离心，得黑褐色沉淀，用FeCl₂溶液15倍体积的浓度为2.0mol/L的高氯酸溶液分散，水洗至中性，干燥，得Fe₃O₄纳米粒子。

所述步骤(2)的方法如下：将Triton X-100、正己醇和环己烷按体积比1∶1∶4混合均匀，加入Fe₃O₄纳米粒子，搅拌均匀，然后加入正硅酸乙酯和氨水，持续搅拌24h，反应结束后，用丙酮破坏乳化，收集颗粒，得硅壳磁性纳米颗粒。其中，加入Fe₃O₄纳米粒子溶液的浓度为5mmol/L，加入的量为Triton X-100、正己醇和环己烷混合溶液体积的2/5；正硅酸乙酯和氨水的加入量分别为Triton X-100、正己醇和环己烷混合溶液体积的20倍。