[发明专利]一套高效分泌表达异源蛋白的工程菌及其应用有效

专利信息
申请号: 201610649512.X 申请日: 2016-08-10
公开(公告)号: CN106282079B 公开(公告)日: 2019-12-31
发明(设计)人: 周志刚;潘兴亮;杨雅麟;李志敏;李娟 申请(专利权)人: 中国农业科学院饲料研究所
主分类号: C12N1/21 分类号: C12N1/21;C07K14/195;C12N9/18;C12N15/75;C12R1/125
代理公司: 11245 北京纪凯知识产权代理有限公司 代理人: 关畅;白艳
地址: 100081 北*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 质量控制体系 胞内蛋白酶 工程菌株 外源蛋白 相关基因 敲除 蛋白 高效分泌表达 枯草芽孢杆菌 感受态细胞 蛋白表达 分泌表达 缺失菌株 一套工具 异源蛋白 工程菌 折叠 失活 分泌 合成 基因 应用 改造 研究
【说明书】:

发明公开了一套高效分泌表达异源蛋白的工程菌及其应用。本发明通过将胞内质量控制体系的相关基因YmfH、YrrN、YrrO和YwpE的敲除载体分别导入枯草芽孢杆菌感受态细胞,分别获得了对应基因的缺失菌株,并在不同工程菌株中表达了CBP21和AIO6BS蛋白。通过实验证明:胞内的质量控制体系的相关基因的失活,不同程度的影响了CBP21和AIO6BS的蛋白表达。说明对胞内质量控制体系相关因子的改造,有利于提高外源蛋白的合成、稳定折叠、分泌。同时本发明的一套胞内蛋白酶敲除的工程菌株,为研究胞内蛋白酶对外源蛋白的分泌表达的影响提供有效的工具,同时也为提高外源蛋白的产量和质量提供了一套工具。

技术领域

本发明属于生物技术领域,具体涉及一套高效分泌表达异源蛋白的工程菌及其应用。

背景技术

枯草芽胞杆菌,是芽胞杆菌属的一种。单个细胞0.7~0.8×2~3微米,着色均匀。无荚膜,周生鞭毛,能运动。革兰氏阳性菌,芽孢0.6~0.9×1.0~1.5微米,椭圆到柱状,位于菌体中央或稍偏,芽孢形成后菌体不膨大。

与大肠杆菌相比,枯草芽孢杆菌能把表达的重组蛋白直接分泌到培养基中,简化了下游处理的时间与成本,是一种理想的表达宿主。虽然芽孢杆菌能高效的分泌表达同源蛋白,但是异源蛋白,特别是在未修饰的宿主中,表达的质量和产率不理想。质量控制系统中的蛋白酶是影响重组蛋白表达的瓶颈之一。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌为如下(1)或(2):

(1)所示的重组菌为降低和/或抑制枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白活性得到的菌;

(2)所示的重组菌为降低和/或抑制枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白活性得到的菌。

上述重组菌中,

所述降低和/或抑制枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白活性为抑制或沉默枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因的表达;

所述降低和/或抑制枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白活性为抑制或沉默枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因的表达。

上述重组菌中,

所述抑制或沉默枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因的表达为敲除枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因或其部分片段;

所述抑制或沉默枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因的表达为敲除枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因或其部分片段。

上述重组菌中,

所述敲除枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因或其部分片段为将枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因替换为抗性基因;

所述敲除枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因或其部分片段为将枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因替换为抗性基因。

上述重组菌中,

所述将枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因替换为抗性基因和所述将枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因替换为抗性基因可以采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行;

所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑;

所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或自杀质粒介导的同源重组。

上述重组菌中,

所述将枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因替换为抗性基因和所述将枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因替换为抗性基因均采用同源重组的方式进行;

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